dbc-偶氮羧共振光散射法测定蛋白质

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1、DBC-偶氮羧共振光散射法测定蛋白质圈2006,Vo1.23No.8亿亏与生物:程Chemistry&BioengineeringDBC一偶氮羧共振光散射法测定蛋白质詹国庆,卢金荣(中南民族大学化学与材舟科学学院分析化学国家民委重点实验室,湖北武汉430074)摘要:基于蛋白质对DBC一偶氯羧光散射增强的效应,拟定了一种测定蛋白质的新方法.在pH4.1的Britton—Robinson(B—R)缓冲溶液中,蛋白质与DBC一偶氮羧结合,产生强烈的共振光散射.在362nm处,共振光散射强度较大.且光散射强度与加入的蛋白

2、质浓度在一定范围内呈线性关系,其中牛血清白蛋白(BSA)在0.05～7mg?L,人血清白蛋白(HSA)在0.O5～8mg?L一,溶茵酶(Iyso)在0.O5～7mg?I.该法用于人血清总蛋白含量的测定,结果令人满意.关键词:共振光散射;DBC一偶氯羧;蛋白质中图分类号:O657.32文献标识码:A文章编号:1672～5425(2006)O8—0058—02蛋白质是组成人体细胞的重要成分,蛋白质的测定对于生化分析和临床医学具有重要意义.近年来,有机染料在生物大分子表面聚集所导致的共振光散射(RLS)分析法,因其灵敏度高,操作

3、简便,显示了适合生化分析的广阔前景,已成功用于核酸1--3]和蛋白质!"等的定量测定.在pH4.1的B—R缓冲溶液中,DBC一偶氮羧与蛋白质相互作用后能产生强烈l的共振光散射,且在一定条件下共振光散射强度与蛋白质浓度呈线性关系,作者基于这一点,建立了蛋白质测定的新的RLS方法,并用于人血清总蛋白含量的测定,结果令人满意.l实验1.1仪器与试剂Lambda35紫外可见分光光度计,Perkin—Elmer公司;PHS一3酸度计,上海第二分析仪器厂.牛Jf【【清白蛋白(BSA,分子量68000.纯度≥95,美国Sigma公司),

4、人血清白蛋白(HSA,分子量68500,纯度96～99,瑞士BM公司),溶菌酶(Lyso,分子量14300.纯度≥95,美国Promega公司);标准溶液均配成1mg?mI的水溶液,4℃冰箱保存,用时稀释至适当浓度;I)BC一偶氮羧溶液,0.5mg?mI～,用时稀释至5Og?mI一;B—R缓冲溶液.所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水.1.2方法在10mI比色管中.依次加入1.0mIDBC一偶氮羧溶液,2.0mIpH4.1的B—R缓冲溶液,混合均匀后加入适量蛋白质溶液,用水定容,摇匀,15min后,在荧光光度计上以激发

5、波长等于发射波长进行同步扫描,可得体系的共振光散射光谱.定量测定时固定一一362rim,测量体系的光散射强度I和试剂空白的光散射强度I.,△I一卜一I..2结果与讨论2.1蛋白质与DBC-偶氮羧的RIS光谱图1为△一0nm条件下,同步扫描激发与发射波长所得的DBC一偶氮羧与蛋白质体系的RIS光谱.a:】mg?L～BSA(无DBC一偶氮羧)b:0mg?IBSA}DBC一偶氮羧c:1mg?1BSADBC一偶氮羧d:2mg?IBSA+DBC一偶氮羧e:5mg?IIjSA+DBC一偶氮羧图lBSA与DBC-偶氮羧共振光散射光谱Fi

6、g.1RISspectraofDBC—carboxyazoandBSA基金项目:湖北省自然科学基金项目(20O5ABA001),中南民族大学自然科学基金重点项目(YZZO3003)收稿日期:2006—05～30作者简介:詹国庆(】952一),女.浙江人,副教授,主要从事分析化学教学及科研工作.詹国庆等:DBC一偶氮羧共振光散射法测定蛋白质/2006年奠8期由l可见,DBC-偶氮羧以及蛋白质本身的光散射强度都比较弱,但二者混合之后共振光散射强度却大大增强了.在362nm,420nm处分别出现了共振光散射峰,且随蛋白质浓度的增

7、加而增大,最大散射峰位于362nm,实验选择一一362nm作为定量测定波长.RIS光谱的这种变化,表明蛋白质与DBC一偶氮羧之问发生了相互作用.2.2反应条件的选择2.2.1溶液pH值的影响(罔2)a:DBC一偶氮羧h:I)BC一偶氮羧BSA图2pH值对共振光散射强度的影响Fig.2Effectofptlvalueonresonancelightscatteringintensity由图2可见.DBC-偶氮羧的光散射强度受pH值影响不大(曲线a),而DBC一偶氮羧与蛋白质结合物的光散射强度受pH值影响明显(曲线b),且pH

8、=4.1时光散射强度达到最大值.故选用pH一4.1的B-R缓冲溶液.其用量在1.O～3.0mI光散射强度稳定,故实验选用缓冲液的用量为2.0mI.2.2.2DBC一偶氮羧用量的影响当DBC一偶氮羧用量较小时,方法灵敏度较低,这是由于BSA不能与I)BC一偶氮羧充分结合.但若DBC一偶氮羧浓度过大,I)B