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1、His标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步的论文摘要】 目的:制备和鉴定抗his标签单克隆抗体（mab）,初步建立检测和纯化带his标签融合蛋白的方法。方法:用碳化二亚胺法合成his-tag完全抗原,免疫balb/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,通过有限稀释法和间接elisa法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mab进行特异性鉴定。结果:his-tag完全抗原偶联成功,经细胞融合、筛选及克隆化,成功获得1株分泌his标签mab的杂交瘤细胞株。制备腹水测得腹水效价高于1
2、∶106,且此株mab与其他融合蛋白标签无交*反应,并在含his标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果。结论:成功制备了1株his标签mab,为带his标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具。【关键词】his标签单克隆抗体蛋白印迹 his-tag是由6个组氨酸(his-his-his-his-his-his)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化,his-tag融合标签与其他标签相比有很多明显优势,是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种［1］。利用his标签可以建立一个基于融合蛋白的高效检测和纯
3、化系统。目前商品化his-tag的单克隆抗体(mab)种类不多,且价格也十分昂贵。因此,研制出his-tag的mab,在融合蛋白质的研究中具有非常广泛的应用前景。.cOm 1材料和方法 1.1材料his六肽为西安蓝晶生物科技有限公司合成;卵清白蛋白(ova)、牛血清白蛋白（bsa）、兔抗小鼠iga、igg1、igg2a、igg2b、igg3和igm抗体均购自sigma公司;hrp标记的羊抗鼠igg由河南省生物工程技术研究中心提供;multiskanmk3酶标仪购自thermo公司;3326型co2培养箱购
4、自forma公司;硝酸纤维素膜（nc膜）购自amersham公司;sds-page电泳仪购自bio-rad公司;balb/c纯系雄性小鼠（鼠龄6～8周,体质量18～22g）购自中国医学科学院动物研究所。 1.2方法 1.2.1人工抗原的合成（1）免疫原的合成:称取4.4mghis-tag和5mgova溶于1mlpb（0.05mol/l,ph7.0）中,充分溶解后,将200μl含有2.2mgedc的pb溶液逐滴加入,边滴入边混匀,摇床100r/min反应4h,4℃静置过夜,用0.01mol/l,ph7.0p
5、bs透析72h,存储于-20℃备用。（2）包被抗原的合成:合成方法同免疫抗原的合成,载体蛋白为bsa。 1.2.2杂交瘤细胞株的建立按本室常规方法免疫balb/c小鼠（20～30μg/只）,末次免疫后免疫小鼠血清效价达到1∶10000以上,进行细胞融合,并以间接elisa法筛选分泌抗his-tag的阳性克隆。克隆化及腹水制备,均按实验室常规方法进行。 1.2.3mab特性鉴定（1）效价测定:以bsa-his-tag（100ng/孔）包被elisa板,腹水从1∶1000开始作10倍稀释。用间接elisa法进
6、行测定。（2）mab特异性鉴定:用于抗体交*反应性研究的为常用蛋白标签,c-myc、多聚精氨酸、flag、钙调蛋白结合多肽、β-actin、谷胱甘肽s转移酶(gst)、葡萄球菌蛋白a(spa)、麦芽糖结合蛋白、硫氧化还原蛋白及ig的fc段,用间接elisa法测定。（3）抗体蛋白纯度测定: 抗体纯度测定采用sds-page凝胶电泳分析。（4）ｉｇ类和亚类的鉴定:mab类型及亚类鉴定采用双向琼脂扩散试验［2］和用兔抗小鼠iga、igg1、igg2a、igg2b、igg3和igm酶标抗体的间接elisa试验检测。
7、 1.2.4mab在检测带his-tag的融合蛋白中的初步应用（1）酶标抗体的制备及活性测定:酶标抗体的制备采用改良过碘酸钠法［3］。酶标抗体活性测定方法:将包被抗原用包被液稀释成100ng/孔包被96孔酶标板,4℃过夜,洗涤后分别加入梯度稀释的酶标抗体,37℃温育30min,洗涤;加底物显色20min,加终止液终止反应,用酶标仪测吸光值。取a值为1.0左右时所对应的酶标抗体稀释倍数为其效价。（2）融合蛋白的检测:采用蛋白印迹法对本基因工程实验室所纯化的带his-tag的基因工程蛋白进行检测［4］。 2结果
8、 2.1杂交瘤细胞株的建立及mab的特性鉴定获得1株高亲和力、高特异性杂交瘤细胞,命名为3a-3。此株细胞经过多次传代、3次冻存及复苏,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。此株mab经检测,腹水效价达到2×10-6;mab经双向琼脂扩散试验和间接elisa法检测为:igg1;各种融合蛋白标签与his-tagmab均无交*反应性;sds-page电泳结果显示:抗体纯度≥90%。 2.2酶标抗体活性测定结果由酶
