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？分类号Ｓ８５２．６５為请泉達义聲＿‘■．ｔ－：．、．．硕±学位论文抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴疋陈雪晴？？＇？＇■？；■－■一．．■．指导教师姚火春教授祁巧副研究员专业学位兽医硕击ｉ研究领域预防兽医学．１＊研究方向兽医微生物与免疫学Ｈ＂＂答辩日期二〇—五年五月＇‘．Ｘ卢‘？＊ｒ／－Ｖ？－、一＇，Ｊ■．．。Ｖ扣－．．．．．．＊■■ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＡＮＤＰＲＥＬＩＭＩＮＡＲＹＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＮＥＵＴＲＡＬＵＺＩＮＧＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＹ乂ＧＡＩＮＳＴＩＮＦＬＵＥＮＺＡＶＩＲＵＳＢｙＣＨＥＮＸｕｅｑｉｎｇＤｉｒｅｃｔｅｄｂＰｒｏｆ．ＹＡＯＨｕｏｄｈｕｎａｎｄＩＸｉａｎｙＱＡＴＨＥ糾ＳＳｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏＮａｎｉｎＡｒｉｃｕｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｊｇｇｙ虹化ｒｔｉａｌＦｕｉｌｌｍｅｎｔｏｆ化ｅＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓＦｏｒＭａｓｔｅｒＤｅｇｒｅｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙＣｏｍｐｌｅｔｅｄｉｎＭａｙ２０１５ＣｏｍｍｅｎｃｅｍｅｎｔｉｎＭａｙ２０１５ 原创性声明！本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行巧。兜工作所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中Ｗ明确方式标胡。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。？学位论文巧者（需亲笔）签名１ｉＴ：禱憂＾Ｗ年＾月之巧学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学巧保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅？。本人授权南京农业大学可Ｗ将本学位絶文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可！＾采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□。本学位论文属于不保密ｋ／，在＿年解密后适用本授权书＿＂＂（请在队ＪＬ方框内打Ｖ）学位论文作者（需亲笔）签名：年ｂ月＞日导师（需亲笔）签名；年（？月日＞ 目录摘要ＩＡＢＳＴＲＡＣＴＩｌｌ引ＷＶ第一篇文献综述摘Ｍ３１流感病毒的生物学特征４１．１血凝素和神经急酸巧的分子特征和进化５１．２流感病毒其他内部基因编码的蛋白及功能７２甲型流感病毒中和抗体８２．１针对ＨＡ头部的抗体９２．２针对ＨＡ茎部广谱中和抗体１０２１２．３甲型流感病毒的通用流感抗体３乙型流感病毒的广谱中和抗体１３４ＮＡ中和抗体的简述１４５国内流感病毒广谱中和抗体的研究进展１４总结与展望１７１９参考：＾献第二篇试验部分摘要２９１材料与试剂２９１．１材料２９１．２试剂配制３０２方法３１２丄１抗原制备３１２丄２动物免疫３１２丄３血凝抑制法初步检测多克隆抗体的效价３２２丄４细胞融合３３２丄５杂交瘤细胞的筛选３３２丄６杂交瘤细胞的克隆３４２３．２单克隆抗体的初步鉴定５２．２．１微量中和试验检测单克隆抗体的中和活性３５２．２．２血凝抑制法检测单克隆抗体的血凝抑制活性如３实验结果巧１ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定４试验结论４２讨论与总结４５参考文献４７＾ｍ４９ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定摘要每年春冬两季都可能会有季节性流感的发生，在世界范围内，季节性流感对人类的生命安全造成了严重的影响。而当新的流感病毒流行株出现，且人类对该流行株不具有有效抵抗力时，便会造成流感大流行。近年来，出现了许多禽流感感染人。这些。而，并导致死亡的病例均严重威胁着人类的生命安全现在普通疫一苗接种和抗流感药物已不再是流感防治的唯手段了，流感病病毒广谱中和抗体的研究为预防和治疗流感提供了新的方法。近几年，流感病毒广谱中和抗体的研一定的成就和进展究取得了。而这些成就与进展也推动了其他相关领域的发展，＂、及如广谱疫苗的发展，新的普遍保守位点的发现基础研究等。本次试验主要通过杂交瘤细胞技术制备了１０株流感单克隆抗体，并通过微量中和试验＂及血凝抑制试验对这１０株单克隆抗体进行初步鉴定。１流感单克隆抗体的制备用甲型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ２和乙型流感病毒分别对小鼠进行免疫海种病毒３只小。王次后血凝血清抗体对甲型Ｈ１Ｎ１、免疫鼠免疫，用抑制法分别检测Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ２和己型流感病毒的血凝抑制效价。血清抗体的血凝抑制效价大于４０时，即可进行细胞蘇合。融合前五天对小鼠进行加强免疫，激活记忆细胞，－使之成为能分泌抗体的Ｂ细胞。细胞融合后，培养４５天，利用血凝抑制法初步筛选出阳性化进行克隆。收集由单个克隆护增出的杂交瘤细胞所产生的抗体上清，通过血凝抑制试验对该抗体上清进行粗筛。试验初步筛选出了２０Ｃ５、２０Ｈ７、Ｆ７、５、３巧、９Ｅ６、１９Ｃ９、４Ｇ４４Ｅ４、１０Ｂ６和２Ｆ７等１０株可能对流感病毒具有血凝抑制活性的单克隆抗体。２流感单克隆抗体的初步鉴定通过微量中和试验和血凝抑制试验对这１０株单克隆抗体进行初步鉴定。利用微量中和试验初步检测这１０株单克隆抗体对甲型流感病毒的Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２亚型レ乂及公型流感病毒的Ｙａｍａｇａｔａ系的中和活性。初步筛选出了４株可能对这３种流感病毒同时具有中和活性的单克隆抗体。用这４株单克隆抗体进行微量中和试验检测其对Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９和Ｈ９Ｎ２亚型的甲型流感病毒＂、及己型流感病毒的Ｙａｍａｇａｔａ系和Ｖｉｃｔｏｒｉａ系的中和活性。最后利用血凝抑制试验检测这３株单克隆抗体对除Ｈ７Ｎ９亚型＂外的６种流感病毒的血凝抑制活性。关键字：甲型流感病毒；乙型流感病毒；血凝素；神经氨酸酶；单克隆抗体；中和活性；血凝抑制活性Ｉ ＡＢＳＴＲＡＣＴＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＡＮＤＰＲＥＬＩＭＩＮＡＲＹＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＮＥＵＴＲＡＬＩＩＺＩＮＧＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＹＡＧＩＮＳＴＩＮＦＬＵＥＮＺＡＶＩＲＵＳＡＢＳＴＲＡＣＴＳｅａｓｏｎａｌｉ打ｆｌｕｅｎｚａｏｆｔｅ打ｏｃｃｕｒｉ打Ｓｐｒｉｎｇａｎｄｗｉ打ｔｅｒ．Ｉｔｂｒｉ打ｇｓｓｅｒｉｏｕｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｈｕｍａｎｂｏｄｙｉｎａｌｌｏｖｅｒｔｈｅｗｏｒｌｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔｌｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｏｆａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｙｈａｖｅｍｕｔａｔｅｄｔｈａｔｃｏｕｔｔｔｔ．Ｉ＾ｌｄｉ打ｆｅｅｈｕｍａｎａ打ｄｌｅａｄｈｅｍｏｄｅａｈｏｗａｄａｓｏｒｄｉｎａｒ，ｙ，ｙｌｔｔｎｚａｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｖｉｒａｌｄｒｕｓｗｏｕｄｎｏｔｂｅｈｅｏｎｌｗｏｗａｓｔｏｒｅｖｅｎｔｎ．ｇｙｙｐｉｆｌｕｅ，Ｔｈａｔｓｗｈｙｂｒｏａｄｌｉｎｆｌｕｅｎｚａｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎ呂ａ打ｔｉｂｏｄｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｗｔｒｅａｔｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄｙｙｐｔｈａｔｈａｓｏｂｔａｉｎｅｄａｒｅａｔａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅｍｅｎｔｉｏｎｅｄｒｏｒｅｓｓｈａｓｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｅｄｉｎｇｐｇｐｓｏｍｅｐａｒｔｓ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｒｏａｄｌｙｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅ，ｔｈｅｂａｓｉｃｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｎｅｗｃｏｍｍｏｎｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｉｔｅｓａｎｄｓｏｏ打．Ｉｎｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎ，ｇｈｙｂｒｉｄｏｍａｔｅｃｈ打ｉｑｕｅ，ｗｈｉｃｈｍａｋｅｓｓｏｍｅｉｎｆｌｕｅｎ之ａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｗｉｎｂｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｂａｓｅｄｏｎｓｏｍｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅｓｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓａｉｍｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｂａｓｉｃｑｕａｌｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｓｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＩＴｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．２ｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓｓｕｃｈａｓＨｌＮｌａｎｄＨ３Ｎ９Ｎ２ａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｚａＢｖｉ，ＨｒｕｓｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｔｅＥａｔ？ｉｍｍｕｎｉｚｅｍｉｃｅｒｅｓｐｅｃｉｖｌｙ．ｃｈｖｉｒｕｓｗｅｒｅｕｓｅｄｏｉｍｍｕｎｚｅｔｈｒｅｅｍｉｃｅ．ＡｆｔｅｒｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓｅｍａｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｔｅｓｔＨＡＩｗａｓｉｈ，ｇｇ（）ｕｔｉｌｉｚｅｄｔｏａｓｓａｙｔｈｅｈｅｍａｇｇｌ山ｉ打ａｔｉｏｎｉｎｈ化ｉｔｉｏｎｔｉ化ｒｏｆｓｅｒｕｍａｎｔ化ｏｄｉｅｓｆｏｒｅａｃｈｖｉｒｕｓＷｈｅｎｔｈｏｓｅｔＵｅｒｓａｒｅａｂｏｖｅ４ｃｅｌｌｆｕｓｉｏｎｃｏｕｅｒｏｃｅｓｓｅ．．０ｌｄｂｄ，ｐＴｈｒｅｅｄａｙｓｂｅｆｏｒｅｆｕｓｉｏｎ，化ｏｓｅｍｉｃｅｓｈｏｕｌｄｂｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄａｇａｉｎｔｏａｃｔｉｖａｔｅｔｅｍｅｍｏｒｃｅｌｈｌｓｏｎｖｅｒｔｅｄｍｅｍｏｒｃｅｌｓｉｎｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｗｈｃｏｕｙｌ．ＣｙＢｉｃｈｌｄｓｃｏｒｅ化ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｆｔｅｒｆｏｕｒｏｒｔｈｒｅｅｄａｙｓ，Ｔｈａｔｈｙｂｒｉｄｏｉｎａｓｃｏｕｌｄｂｅｃｉｏｎｅ－ｄｔｅｔｗｈｉａｒｉｅｅｎｅｄｉｓｆｒｏｍｈｐｏｓｉｉｖｅｈｏｌｅｓｃｈａｒｅｒｅｌｉｍｉｎｌｓｃｒｂｈｏｌｅｈｅｍａ，ｐｙｙｇｇｉｏ打ｉｎｈ化ｉｔｉｏｎＩｔｃｏｕｌｄｂｅｃｏｌｌｅｃ１；ｅｄ１：ｈａｔａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｒｅｒｏｄｕｃｅａ＾Ｗｉｎａｔ．ｐｄｂｙ－－ｓｉｎｌｅｃｌｏｎｅｄｈｂｒｉｄｏｍａ．Ｆｉｎａｌｌｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｓｕｃｈａｓ２０Ｃ５２０Ｈ７ｇｙｙ，，，５Ｆ７，３Ｆ７，９Ｅ６，１９Ｃ９，４Ｇ４，４Ｅ４，１０Ｂ６，２Ｆ７，ａｒｅｓｅｌｅｃ１：ｅｄｂｙｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｔｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅｓｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｈａｖｅｐｏｋｎｉａｌｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏ打ａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ．２Ｔｈｅｒｅｌｍｉｎａｒｄｅｎｔｉｉｃａｔｏｎｏｆｉｎ打ｕｅｎｚａｍｏｎｏｃｌｏｎａａｎｉｂｏｄｅｓ．ｐｉｙｉｆｉｌｔｉａｔｏｎｏｆ－ｈｅｒｅｌｉｍｉｎｒｙｉｄｅｎｔｉ打ｃａｉｔｈｏｓｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｃｏｕｌｄｂｅａｎａｐｚｅｄｂ－打ｅｕ－ｍｉｃｒｏｔｒａｌｉｚａｔｉｏ打ａｎｄｈｅｍａｌｕｔｉ打ａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｆｏｕｒｓｔｒａｎｓｏｆｌｙｙｇｇｉ－ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄａａｉ打ＳｔＨｌＮｌＨ３Ｎ２ｖｉｒｕｓａｎｄｉ打ｆｌｕｅｎｚａＢｇ，ｖｉｍｓＹａｍａｇａｔａｌｉｎｅａｇｅｈａｖｅｂｅｅｎｓｅｌｅｃｔｅｄｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｂｙｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ－ｎｅｕｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｓｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｍａｙｈａｖｅｂｒｏａｄｌｙｔｒａｌｉｚｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｔｈｅ打ｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｏｓｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔ化ｏｄｉｅｓｃｏｕｌｄｂｅａｓｓａｙｅｄＩＩＩ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定ｔｈｅｈｅｍａｕａｎｉｎｈ－Ｗｉｔｈｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｆｉｎａｌｌｙｇｇｌｔｉｎｔｉｏｉｂｉｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒ比ｏｓｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｃｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏ凸ｉｎｈ化化ｏｎ化巧．ＫＥＹＷＯＲＤＳｅｎｚａｒｕｓｎｕｅｎｚａＢｖｒ－：ｉｎｆｌｕＡｖｉｉｆｌｉｕｓｈｅｍａｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｎｅ，，ｇｇ，ｕｍ－ｒａｉｎｉｄａｓｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｈｅｍａｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｉｎｈｂｉｔｏｎａｃｔｉｖｉｔｎｅｕｔｒａｌｉｚａ，ｙ，ｇｇｙ，巧ｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｒｖ ＾引言流行性感冒简称流感一，是指由于流感病毒感染而引起的种急性呼吸道疾。每年都会有季节性流感流行。病，偶尔会发生大流行季节性流感主要是由甲型Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２和乙型流感病毒交替流行引起的。，有时也会出现同时流行的情况在世界范围内，无论是季节性流感还是偶尔发生的大流行都会对人类的生命健康造成严重的威胁。特别是禽流感Ｈ５Ｎ１和Ｈ７Ｎ９在人群中的传播，揭示了禽流感病毒也会发生变异。由于人类缺少对禽流感病毒的抵抗力导致，最终可感染人类感染禽流感的患者的死ｔ率商于普通流感。一直Ｗ来抗病毒药物和疫苗接种是抵抗流感病毒感染的主要方法。但近年来出现了越来越多的抗扎那米韦和奧司他韦的耐药毒株。流感疫苗则需要经常更新一，如果研制的疫苗无法与下季流行毒株匹配，会造成即使接种疫苗也无法有效抵抗流行的流感病毒。并且流感疫苗研制时间较长，送都不利于流感的防控。因此研制流感病毒广谱中和抗体便成了一个更好的选择。一种单克隆抗体流感广谱中和抗体是，具有单克隆抗体的优势，同时也具有一广谱性，其广谱性具有两方面的含义。第，广文的广谱性。广义的广谱性是指该单克隆抗体能够同时中和多个亚型的甲型流感病毒或者乙型流感病毒的两个。二系的毒株，甚至可Ｗ同时对甲型和乙型的流感病毒产生中和作用第，狭义的广谱性。狭义的广谱性是指该抗体对某个亚型或者某个系的流感病毒的不同毒株具有中和活性。这是因为同亚型的不同毒株之间也存在着不同程度的差异。广谱。中和抗体是Ｗ病毒颗粒上的普遍保守表位为目标，从而实现其广谱性这对制备保护性治巧抗体，寻找普遍保守的抗原表位用Ｗ研制广谱疫苗，建立血清学诊断Ｗ及其他基础研究等都具有很重要的意义。１０本实验利用杂交瘤细胞技术制备了株单克隆抗体，通过微量中和试验Ｗ及血凝抑制试验对这１０株单克隆抗体的基本性质进行初步检鉴定，为后续的深入研究提供资料。Ｖ 文献综述第一篇文献综述１ 流感病毒中和抗体的研究进展摘要每年都会有季节性流感流行，偶有大流行发生。在世界范围内，无论是季节性流感还是偶尔发生的大流行都会对人类的生命与健康造成严重的成胁。而流感病病毒广谱中和抗体的研究发现为预防和治疗流感提供了新的思路。近年来，流一－定的进展。抗体ＣＨ６５、Ｓ１Ｉ０５Ｄ１８感广谱中和抗体的研究取得了巧／、Ｃ和都ＨＡ。抗体Ｃ１７９Ｒ６２６１Ｆ１０ＣＲ８０２０ＣＲ９１１４是结合头部的单克隆抗体、Ｃ、、、和＂－Ｆ１０是可、结合到ＨＡ茎部的单克隆抗体。抗体ＣＨ６５和Ｄ１８属于狭义的广谱抗体，他们分别是Ｈ１和Ｈ３亚型的广谱抗体。抗体Ｃ１７９、ＣＲ６２６１和Ｆ１０是ＨＡ组１流感病毒的广谱抗体。抗体ＣＲ８０２０为ＨＡ组２流感病毒的广谱抗体。抗体ＣＲ９１１４与Ｆ１６及ＦＩ３７０是ＨＡ组１和ＨＡ组２的通用广谱抗体，其中抗体ＣＲ９１１４虽然在乙型的中一体外不显示对和效应，但在动物实验中，该抗体能保护被定剂量乙型Ｓ１３９０５ＨＡ流感病毒感染的小鼠。抗体／１和Ｃ可中和部分组１和ＨＡ组２的病毒，其中和范围小于抗体ＣＲ９１１４和ＦＩ６ｖ３。而抗体ＣＲ８０７１和ＣＲ８０３３是针对己型流一定的成感病毒的广谱抗体。另外，国内流感病毒广谱中和抗体的研究也取得了就。本文就上迷流感病毒广谱中和抗体的研究进行综述。关键字：流感病毒；生物学特征；广谱单克隆抗体；血凝素中和抗体；ＮＡ中和抗体流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。据估计，全球每年约有－亡病例中又Ｗ老人１０亿人受季节性流感的影响，其中约有２５５０万人死亡，而死、婴幼儿、孕妇Ｗ及免疫力低下者居多。在２０世纪发生了Ｈ次流感大流行，导致了超过５０００万人死亡。而在２００９年发生了由甲型Ｈ１Ｎ１（ｐｄｔｎ２００９）引起的本２０一世纪首次流感大流行。１３年２月，在中国出现了种新型的禽流感病毒Ｈ７Ｎ９，该病毒可感染人类并可引起严重的疾病。流感的流行对人类的健康和经济造成了ｔＷ重大影响。普通的疫苗接种和抗流感药物是流感防治的重要手段。但近年来，出现了越来越多能够抵抗流感药物的耐药毒株。幸运的是，在这种情况下，并没有证据显Ｗ一示耐药毒株具有人与人之间传播的特性。在这样的情况下接种疫苗便成为了个较好的选择，同时疫苗接种也可引起机体产生中和抗体。但与许多其他疫苗相一同，，流感疫苗需要经常更新Ｗ有效对抗可能在下个流感季节出现的新的流感病毒流行株疫苗从生产到应用所需的时间较长，并且疫苗的有效性取决于疫苗株与流行株之间的匹配程度。由于上述问题的存在，流感病毒中和抗体的研究３ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定越来越受到重视，，特别是在忽略病毒亚型差异性的广谱性中和抗体研究方面取得了很大的进展。１流感病毒的生物学特征流感病毒属于正粘病毒科，是单股负链的ＲＮＡ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）病毒。依据核蛋白（ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＰ）和基质蛋白（ｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＰ）的抗原特性，流感病毒可分为甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。甲型和乙型流感病毒的基因组由８个不同的节段组成。病毒ＲＮＡ由多个ＮＰ分子松散地包被着，该复合物含有３种病毒聚合酶蛋白（ＰＢ１，ＰＢ２和ＰＡ），均位于核衣壳的末端，形成核糖核酸蛋脚ＲＮＰ）白复合体（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓｓ。甲型流感病毒的８个ＲＮＡ节段可至少编码１１种基因产物。这些基因产物包括ＰＢ１，ＰＢ２和ＰＡ聚合酶，ＮＰ核蛋白，Ｍｌ基质蛋白和Ｍ２离子通道蛋白，Ｎ邸（Ｎｕｃｌｅａｒｅｘｐｏｒｔｐｒｏｔｅｉｎ）核输出蛋白Ｗ及ＮＳ１（Ｎｏｎｓｔｍｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ）非结构蛋白，－Ｆ２蛋白Ｗ另外还有ＰＢ１及２个重要的表面抗原蛋白，血凝素ＨＡ（Ｈｅｍａｇｇ山ｔｉｎｉｎ）８－１０ＮＡ【］和神经氨酸酶（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）。在宿主免疫压力和药物等的作用下，ＨＡ和ＮＡ的抗原位点和耐药位点容易，乙型次之发生变异。其中甲型流感病毒最容易发生变异，丙型流感病毒则相对Ｗ稳定。引起送８个ＲＮＡ片段发生变异的机制主要包括：基因突变和基因重配。基因突变是指由于病毒ＲＮＡ聚合酶没有校对能力，在免疫压力等原因作用Ｗ下，导致流感病毒ＨＡ和ＮＡ的基因片段发生点突变、置换或缺失等突变。在季节性流感病毒中，点突变可导致抗原漂移，而抗原漂移是引起同亚型不同毒株之间差异的主要原因。基因重配是指当不同的母代病毒同时感染同一ＲＮＡ片段随宿主时，病毒的机惨入子代病毒中，因此可Ｗ产生含有新组合基因的子代病毒。这主要是由于流感病毒ＲＮＡ是分节段的Ｗ。基因重配可能会引起编码ＨＡ和ＮＡ的节段发生重配，从而产生新的流感亚型，该现象称为抗原转移。在已发生的流感大流行中，１９１８年、１９７７年和２００９年的大流行由Ｈ１Ｎ１亚型流感病毒引起，１９５７年的流感大流行由Ｈ２Ｎ２亚型引起，而１９６８年的流感大流行则由Ｈ３Ｎ２亚型的流感病毒引起１９１８９５７１９６８年的大流行有证据表明其ＨＡ来源于。对于年、１年和，禽类流感病毒。１９６８年的Ｈ３Ｎ２亚型的Ｎ２来源于１９６７年的Ｈ２Ｎ２亚型的ＮＡ。２００９年的Ｈ１和Ｎ１似均来源于猪源的ＨＡ和ＮＡ。４ 流感病奉中和抗体的研巧进展１．１血凝素和神经氨酸酶的分子特征和进化血凝素和神经氨酸酶是流感病毒颗粒表面上的两种重要糖蛋白。这两种且都可识别唾液酸Ｗ。糖蛋白是抗流感疫苗的重要免疫原，并病毒感染的初始阶－ｉｓ２［Ｗ段需要多个血凝素（ＨＡ）与细胞表面的唾液酸受体相结合。病毒复制后，－受体破坏酶ＮＡ，从感染细胞的表面水解其底物唾液酸，使新的病毒被释放出来Ｐ３１感染更多细胞其中ＨＡ是病毒中和抗体的主要鞭标，而ＮＡ则是有效Ｐ４１抗流感药物的鞭标。目前发现，甲型流感病毒的ＨＡ有１８种不同亚型，ＮＡ有１１种亚型，其中Ｈ一１７Ｎ１０和Ｈ１８Ｎ１１是通过新代测序技术从骗幅体内所分离出来的流感病毒基Ｐ５，２６ｌＨＡ１因组。通过基因进化分析，可将各亚型分为两个基因组：第组中包含Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７和出８；第２组包口７－３０４Ｈ］７、Ｈ１０、Ｈ１４、Ｈ１５。含照、Ｈ、ＮＡ也可分为Ｈ个组：组１包含Ｎ１、２５－３２Ｎ４［］、Ｎ５、Ｎ８２包含Ｎ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７Ｎ９３包括Ｎ１０Ｎ１１。；组和；组和ＰＳｌ，ａｍａａｔａ系和Ｖ而艺型流感病毒则分为两个不同的进化谱系即Ｙｇｉｃｔｏｒｉａ系。ＨＡ蛋白是流感病毒粒子上的一一种重要的表面抗原，它是个由Ｈ个相同亚基组成的Ｈ聚体，它主要负责病毒与宿主细胞上受体的结合Ｗ及病毒外膜与宿主ＨＡ。ＨＡ细胞膜的融合。由介导的病毒进入细胞内的过程需要两步首先，与细胞受体唾液酸相结合。随后通过内吞作用完成病毒内化后，ＨＡ在低ＰＨ值的诱导下进行明显的构象变化，然后引起病毒外膜与细胞膜相融合，最终病毒将基因３４３５１’１ＨＡ与唾液酸的结合。具有种属特异性组释放到宿主细胞的细胞质中而。禽ａ－２－和马的流感病毒倾向于结合半乳糖３唾液酸，人类的流感病毒倾向于结合，ａ－２６－－２３－唾液酸和ａ－２６－唾液酸都能结合唾液酸，猪的流感病毒似乎与ａ，，，－－－在人体内２６２－，上呼吸道组织和气管中主要包含ａ，唾液酸，而肺組织中含有ａ６，Ｗ心－－唾液酸和ａ２３唾液酸的混合物。而在能感染人的禽流感中，如Ｈ７Ｎ９，突，ＨＡ具有部分结合ａ－２６－－－，２，唾液酸特性但它还是更倾向于结合ａ３唾变导致其，Ｗ。液酸，这也是它目前未出现人与人之间传播的重要原因ＨＡ由ＲＮＡ节段４编码。ＨＡ在翻译过程中需要经历王次加工：蛋白水解，－糖基化和脂肪酸醜化。新合成的ＨＡ需要进行切割，除去含有１４１８个氨基酸的氨基末端疏水性序列，这是运输到细胞膜的信号序列。糖基化的数量和位置因病毒株的不同而不同。脂肪酸醜化是将栋桐酸添加到ＨＡ綾基末端附近的半脫氨酸残基上。最后的处理步骤是将ＨＡ裂解为两个亚单位，ＨＡ１和ＨＡ２（未裂解的ＨＡ叫ＨＡ０）。约３２４个氨基酸加上可变的碳水化爸物构成ＨＡ１（Ｈ３亚型），约２２２个氨基酸加上可变的碳水化合物和栋搁酸残基构成ＨＡ２（Ｈ３亚型）。ＨＡ１和ＨＡ２通过二硫键连接。这种裂解是由宿主产生类膜蛋白酶来完成，该裂解对５ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制各及初步鉴定－，膜融合潜能的活化是必不可少的，裂解后病毒可具有感染力因为病毒细胞諫合是由ＨＡ２的游离氨基末端介导的。Ｈ５和Ｈ７亚型部分成员的裂解位点的多个一残基可Ｗ被细胞内的种类枯草杆菌蛋白酶所识别。在这些情况下，裂解效率高，病毒感染性高，而且这些病毒都会是高致病性病毒。在所有情况中，酶裂解会产＂＂ＨＡ—生带有Ｎ末端的融合肤，个保守不带电荷的区域这是，在膜融合中８＂４８１［’起着重要的作用。裂解后的ＨＡ，由ＨＡ１由构成其头部，全部的ＨＡ２和部分ＨＡ１构成其茎部。一ＨＡ的头部主要个受体结合位点（ｒｅｃｅｔｏｒｂｉｎｄｉｎｓｉｔｅＲＢＳ）。有ｐｇ，Ｗ及其他表位实验证明，３Ｄ结构中ＨＡ的唾液酸结合位点可能是由去除了顶端的头部部分构成的。而ＨＡ球状头部的其他表位主要分为五簇位点；拟病毒ＨＡ头部有Ａ、Ｂ、４９５〇［’］ＨＡＣ、Ｄ和Ｅ五个位点，而Ｈ１病毒头部则分为Ｓａ、Ｓｂ、Ｃａ、Ｃａ２和ＣｂｉＷｌ五个位点。而这些位点很容易发生变异，但这并不影响病毒的受体结合活性心Ｉ某些病毒ＨＡ的基部一些保守氨基酸３亚型ＨＡ氨基酸序列为含有。如ＷＨ－－－－１１标准，酪氨酸９８、丝氨酸１３６、色氨酸５３和亮氨酸９４四个位置的氨基酸在８ｔ４’５３ＨｌＡＨＡ２的３、Ｈ５和拟亚型中相对保守。Ｈ的茎部相对来说比较保守，竣基末端区域包含疏水跨膜序列和有栋禍联接的终端细胞质定位序列乙型流感的ＨＡ序列与甲型流感的ＨＡ序列的相似度可达到２５％。艺型流感ＨＡ上有四个主要的表位１２０１６０１９０：环、１５０环、环和螺旋。这四个主要的表一一位在空间上靠在起形成个大的，连续的抗原位点。类似于甲型流感病毒的ＨＡ，艺型流感的抗原性位点由膜远端区域的各种表面环组成，位于ＲＢＳ的附近。对整个流感病毒家族中已知结构的ＨＡ进行系统比较发现，进化上保守的电离残基存在于链与亚基相接的所有区域。这些离子化的残基与ｐＨ依赖性的结构基础ＰＷ－和流感ＨＡ离子强度的灵敏度Ｗ及血凝素醋酶融合蛋白有关。ＮＡ是病毒体的第二个主要表面抗原，它可从糖蛋白或搪脂的末端切除唾液酸，从而释放新合成的病毒粒子。糖基化的ＮＡ具有氨基末端疏水性序列，该序列既可作为传送到细胞膜的信号也可作为跨膜结构域。免疫标记实验表明，ＮＡＷ并不是均匀地分布于病毒外膜上。ＮＡ是由ＲＮＡ节段６编码的，ＮＡ是由四个相同亚基构成的磬茹形四聚体，薦茹头通过分子直径约为６０－Ａ的细长茎轩悬挂在病毒膜上，不同毒株间的茎杆一一长度是不样的。每个构成磬茹头的亚基是由个六叶螺旋奖状的结构组成，这ｗｓｔ’ｙ－。ＮＡ的活性区域些叶片由四个Ｐ结构的反向平行链所形成在，包含了许多Ａ－带电荷的保守氨基酸残基，这些残基大约位于每个亚基的中也Ｎ配体复Ｘ射线晶一，与ＨＡ相比合物的体学分析表明，ＮＡ可通过另种不同的方式识别－５６５９一［］Ａ上由毅酸Ｈ唾液酸。在进步研究中发现，Ｎ盐形成的盐娇含有个保守的６ 流感病毒中和抗体的研究进展－－－１１２％和３７１。２精氨酸残基，包括精氨酸８、精氨酸精氨酸从系统进化组１和，，组的ＮＡ的结构叠加发现其活性位点残基的位置非常相似。但是１和组２活５０－ａ－环的构象结构有着显着的差异。在组１中ｌ１４９性位点附近的１，此环Ｖ的位置与组２中相同位置的ｅ－４９约有７Ａ的偏差。此外１Ｉｌ１，第组中１４９残基的疏水性侧链指向与活性位点相反的方向，但在第２组中，它朝向活性位点的。另外，－－这两组ＮＡ之间的保守酸性残基Ａｓｐ１５１和Ｇｌｕ１１９的位置存在显著的差异。这一些差异最终导致在第１组ＮＡ活的性位点附近有个大的空腔，但在组２ＮＡ中却没有送样的空腔一ＮＡ－２在甲型和乙型流感病毒的表面有个共同的保守表位ＨＣＡ，该表位２２２－２３０（ＷＮ２亚型ＮＡ蛋白氨基酸序列为标准）之间位于氨基酸，构成酶活一一ＨＣＡ－３ＮＡ的性位点的部分。还有个保守表位，该表位是甲型流感病毒保守表位，该表位位于ＮＡ的Ｎ末端ＮＡ活性部位也是抗流感药物乐感清（扎那米韦）和达菲（奥司他韦）的主要目标，送两种药物可Ｗ有效作用于甲型Ｗ及２Ｐ＾乙型流感病毒的ＮＡ。虽然在全球范围内抗病毒药物很少使用，但是在２００７－１２００８年的冬季流行的ＨＮ１流感病毒分离株中，耐药毒株仍占据了较重的ｔｗｉ比例。并且通过药物筛选试验发现，某些主要的耐药突变是发生在ＨＡ上而不是ＮＡ上。耐药性Ｈ１病毒毒株在接近ＨＡ唾液酸受体结合位点的氨基酸发生了取代：Ｔ１５５Ａ、Ｖ２２＾、Ｒ２２９Ｉ、Ｋ２２２Ｔ、Ｓ１８妹和Ｓ１６５Ｎ。这些突变明显降低了突变毒株与唾液酸的亲和力，因此导致新产生的变异病毒从已感染的细胞释中放出来时几乎不依赖于ＮＡ活性。从而使抗病毒药物失效１．２流感病毒其他内部基因编码的蛋白及功能ＰＢ２聚合酶。ＰＢ２聚合酶由ＲＮＡ节段１编码。它可ｔＵ激活病毒ＲＮＡ依赖性的ＲＮＡ聚合酶。在病毒信使ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡ，ｍＲＮＡ）转录启动时，ＲＮＡ５＇ＣＡＰＬ结构作为病毒ｍＲＮＡ的转录引物，识别并结合宿主细胞ｍ的。ＰＢ２的部分功能是从宿主ｍＲＮＡ上内切其帽子结构。新合成的ＰＢ２蛋白质迁移到受Ｗ感染细胞的细胞核中。ＰＢ１聚合酶。ＰＢ１聚合酶由ＲＮＡ节段２编码。它的功能是，在ＲＮＡ聚合酶复合物中作为激活新生病毒ｍＲＮＡ延长的蛋白，也可作为模板ＲＮＡ和病毒ＲＮＡ合成过程中的延长蛋白。ＰＢ１蛋白主要聚集在受感染细胞的细胞核内［８］。ＰＡ聚合酸。ＰＡ聚合酶由ＲＮＡ节段３编码。它集中在被感染的细胞核中，—起构成ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶复合物并与ＰＢ１和ＰＢ２。有证据表明，其可７ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定Ｗ能作为蛋白激酶或作为解螺旋蛋白而发挥作用。ＮＰ核蛋白。ＮＰ核蛋白是由ＲＮＡ节段５编码。在被感染的细胞核中与病毒ｔＲＮＡ结合，ｃＲＮＡ（ｃｏｍｌｅｍｅｎａｒＲＮＡ）。除了其结构作用外在ｍＲＮＡＷ及ｐｙ和病毒ＲＮＡ的合成过程中，核蛋白ＮＰ可激活病毒ＲＮＡ聚合酶。在已被病毒感染的细胞中可合成大量的ＮＰ蛋白，其在病毒粒子中的含量仅次于基质蛋白。磯酸化的ＮＰ蛋白具有宿主细胞依赖性，并且可能与病毒宿主范围限制有关。ＮＰＷ是也宿主细胞毒性Ｔ细胞免疫应答的主要祀标。Ｍｌ蛋白质。流感病毒ＲＮＡ节段７是双顺反子，编码Ｍｌ和Ｍ２两个蛋白。节段７的共线转录产生能翻译出基质蛋白的ｍＲＮＡ。基质蛋白Ｍｌ是流感病毒粒子中含量最多的蛋白质。它没有任何已知的酶的活性，它在，但是据推测子代病毒装配起始过程中起着重要作用。基质蛋白构成病毒核衣壳，位于病毒外膜下。Ｗ在被感染细胞的中，它主要存在于细胞质和细胞核中。Ｍ２蛋白。表达Ｍ２的ｍＲＮＡ也是从ＲＮＡ节段７转录而来。它是通过剪接一作用转录得到的。Ｍ２蛋白是流感病毒粒子表面上种较为重要的膜蛋白。这种一蛋白Ｗ四聚体的形态大量存在于被感染细胞的表面，小部分存在于在病毒粒子一中２蛋白是，Ｈ，。Ｍ个质子通道它可Ｗ在ＨＡ合成时调节高尔基体的ｐ值并一Ｗ在病毒脱壳过程中使病毒颗粒内部酸化。其跨膜区域也可作为种运输信号。－ＮＳ非结构蛋白ＮＳ１、ＮＳ２和ＰＢ１Ｆ２。ＲＮＡ节段８编码两个非结构蛋白１２１，ｍＲＮＡ是通过和ＮＳ。ＮＳ基因与病毒ＲＮＡ是共线的而ＮＳ２的剪接作用而得到的，特１，１主要存在。这些蛋白质别是ＮＳ大量存在于受感染的细胞中（ＮＳ，细胞核中，ＮＳ２主要存在细胞质中）但送两种蛋白质均不参与子代病毒粒子中。Ｗ两个蛋白在病毒复制过程中发挥作用。ＮＳ２的作用似乎是调节ＮＳ蛋白的合成。－ＰＢ１Ｆ２是由ＰＢ１基因片段中新发现的开放阅读框架（ｏｅｎｒｅａｄｉｎｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）ｐｇ＋Ｄ－ＡＸ１Ｆ２可编码的。该蛋白可被Ｃ８Ｔ细胞所识别。ＰＢＷ促进ＢＡＫ／Ｂ介导的线粒体外膜透化作用，使细胞色素Ｃ从线粒体中释放出来，从而使宿主细胞死１０［］亡。２甲型流感病毒中和抗体研制广谱中和抗体的主要目的有：制备保护性治疗抗体、寻找不同亚型共同的保守性抗原表位、通过保守表位来研制广谱疫苗、建立并应用于血清学诊断试剂Ｗ及其他基础研究等。目前己发现了多种可针对不同亚型的同种病毒及不同种病毒的广谱单克隆抗体。８ 流感病毒中和抗体的研究进展２．１针对ＨＡ头部的抗体针对ＨＡ头部的广谱中和抗体接触面接较大，能与受体结合位点Ｗ外的不保守区域结合。２０１１年，Ｗｈｉｔｌｅ等人对ＣＨ６５进行了鉴定并对其特征进行了描述。ＣＨ６５是对Ｈ１Ｎ１具有中和活性单克隆抗体。ＣＨ６５是抗体是通过ＲＴ／ＰＣＲ将重排的ＩｇＶｈ和Ｖ，基因从外周血单核细胞中分离出来的，其重链可变区的第１２个位置与．ＵＣＡ（ｕｎｍｕｔａｔｅｄｃｏｍｍｏｎａｎｃｅｓｔｏｒ）不同；其轻链，在可变区的第６个位置与ＵＣＡ不同。单克隆抗体ＣＨ６５结合ＨＡ的球状头部。ＣＨ６５通过其重链互补决定■３上的一区（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎｃｏｍｐｅｍｅｎｔａｒｅｋｒｍｉｎｉｎｒｅｉｏｎ，ＨＣＤ民３）ｌｙｄｇｇ个长多化的尖端插入到ＨＡ１受体结合位点中形成稳定的复合体，并产生很强的结合活性。因为ＣＨ６５在唾液酸结合过程中通过模拟人类受体而与许多保守残基产生类似的相互作用。ＣＨ６５所识别的表位覆盖了受体结合位点和抗原位点ＳＡ、ＳＢ和２Ｃａ２，并且掩埋了ＨＡ上７４８Ａ的区域，该抗体可能使用了５化个ＣＤ民环与该表位的结合。大多数情况下，在１３３ａ位置（第１３３碱基和１３４碱基之间）插入碱性氨基酸Ｌｙｓ或者Ａｒｇ，将会使ＣＨ６５的中和作用对该病毒无效，这种情况在Ｈ１中发生的概率为八％，而在Ｈ５中发生的概率为９４％，所有Ｈ６和Ｈ１０亚２０１３ｃｈｍ５－型的病毒都会发生这种状况。年Ｓｉｄｔ等人对ＣＨ６ＣＨ６７度３株单克隆抗体进行的研究发现，在人类宿主中，无论是利用Ｂ细胞系免疫原的设计方法一６还是对于普通流感疫苗来说可能是个重要的必要条件ｔ，抗体亲和性的成熟都６例〇２００９年Ｙｏｓｈｉｄａ等人最初发表了关于鼠源单克隆抗体Ｓ１３９＾的研究，２０１２年Ｌｅｅ等人对其复杂的结构特征与ＨＡ的关系进行了研究。Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／ｌＷ５Ｈ３Ｎ巧亚型流感病毒ＨＡ与Ｓ１３９／１的ＦＢ片段复合体的晶体结构揭示了抗体的（目标是ＨＡ的头部区域，它与受体结合位点的高度保守残基相结合，并与抗原位点Ａ、Ｂ和Ｄ相接触（ＷＨ３表面抗原表位命名）。单抗Ｓ１３９／１同时使用重链和轻链的５／６个互补决定区（ＣＤＲ）环结合ＨＡ的头部。类似于ＣＨ６５和Ｓ１３９／１通过将其ＨＣＤＲ２插入受体结合区域，直接与内源唾液酸受体相竞争。对不同亚型的病毒，Ｓ１３９／１的Ｆａｂ片段有很宽的亲和力结合范围，蚀斑减少试验显示Ｓ１３９／１１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ１３和Ｈ１６亚型的流感病毒具有中和活性抗体对Ｈ。血凝抑制试，单克隆抗体Ｓ１巧Ａ对Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３和Ｈ１３亚型具有血凝抑制作用验结果显示，对１株Ｈ１毒株和部分Ｈ３毒株的ＨＩ滴度很高，对Ｈ２和Ｈ１３亚型的病毒具有中等活性。２００９年，在Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８３Ｎ巧、Ａ／Ａｄａｃｈｉ／２／５７Ｈ２Ｎ２和Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ（）（Ｈ１Ｎ１）毒株中筛选出了抗单克隆抗体Ｓ１３９／１的变异毒株，并通过序列分析发现这些变异毒株ＨＡ基因在１５６、１５８和１９３（Ｈ３编号）发生了氨基酸取代。可９ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定逃避Ｓ１３９Ａ中合作用的Ｈ１、Ｈ２和Ｈ３突变毒株的突变发生在抗原位点Ｂ（拟）６８９［’６］和抗原位点Ｓｂ（Ｈｌ）。一一２０１２年，Ｅｋｉｅｒｔ等人发现了种可用单的ＣＤＲ环与ＨＡ相结合的单克隆抗体Ｃ０５。通过排或ＭＤＣＫ细胞微量中和试验发现，抗体Ｃ０５能在体外中和－Ｈ－１Ｈ３和Ｈ９亚型的病毒。Ｃ０５是从懂菌体展示技术制备的。Ｃ０５由Ｖｈ３２３和＊一Ｖ１－１ｋ３３０重链和轻链Ｖ基因编码，其分别编码两个独特的结构，Ｃ０５包含２４个残基的ＨＣＤＲ一个３和个含有５个残基体插入物的ＨＣＤＲ１。Ｃ０５的晶体结构与ＨＡ形成的复合物显示，该抗体主要通过其ＨＣＤＲ３与ＨＡ的受体结合位点相结合－。另外在抗原位点Ｂ只有ＨＣＤＲ１与１９０环间会发生轻微的相互作用。与典型抗体相比较，该抗体在ＨＡ上的覆盖的面积相当小。抗体Ｃ０５利用空间位阻抑制病毒与受体的结合１３９／１，。类似于Ｓ该抗体通过亲和力与病毒表面ＨＡ的。ＣＨ６５和Ｓ１３９Ａ相１３３ａ尖断部分相结合与似，在的插入物可通过空间位阻的０５－－冲突阻止Ｃ结合，同样５８２２０５，在残基１和环周围的插入缺失导致Ｃ０不能７Ｄ［］中和Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４和Ｈ１６亚型病毒。通过对Ｓ１３９Ａ和Ｃ０５的研究发现表明可产生针对受体结合位点的异源亚型中和抗体。流感病毒表面相对浓密的ＨＡ簇可Ｗ促进ＩｇＧ的多价结合［７１。通］过亲和力作用，Ｓ１３９／１和Ｃ０５能很好地包容病毒ＨＡ表位上发生的细微变化，这使得它们具有结合不同亚型ＨＡ毒株的能力。不同亚型在受体结合位点周围的环和螺旋上的差异通常使头部结合抗体比茎轩结合抗体更容易受到特异性的限町］制。一－２００８ＷｍｍｍｒｔＤ１Ｄ１－年，ｅ发现了株新的单克隆抗体８。８是通过Ｂ细胞－衍生出来的。血凝抑制试验和微量中和试验发现，Ｄ１８对１＾１３的Ｈ３Ｎ２测试－株具有血凝抑制活性，且Ｄ１８对Ｈ１和Ｈ７没有中和活性，但对流感病毒Ｈ３亚型的不同毒株具有广谱中和活性，且具有高效性。通过对其逃逸突变株的筛选，一发现Ｄ－Ａ头部的１８是流感病毒Ｈ个新型表位为目标，该表位位于Ｈ３Ｎ２病毒中高度保守，并且位于抗原位点Ｄ附近。但如果在Ａｓｎ２０７或者Ａｓｎｌ７１发生－－１１糖基化，贝峻个糖基化可能会干扰Ｄ８的结合。最后试验证明Ｄ８无论是单独使用还是与奥司他韦联合使用，都比奥司他韦具有更好的治愈效果，尤其是在心Ｓ１感染后期。２．２针对ＨＡ茎部广谱中和抗体最初仅认为中和流感的抗体只会对ＨＡ的头部产生免疫反应，然而最近发现了许多能与ＨＡ茎部相结合抗体。ＨＡ茎部区域对于膜融合来说是必不可少的，这些抗体在ＨＡ发生融合构象变化前便可锁定ＨＡ，而这些构象变化对于病毒进１０ 流感病毒中和抗体的研究进展入细胞来说是必不可缺少的。相对于头部结合的抗体，茎部结合的抗体似乎可ＷＰ３１通过阻止宿主和病毒膜的融合来中和流感病毒。一在１９９３年Ｏｋｕｎｏ等人第次发现了可Ｗ针对ＨＡ高度保守的茎部区域的中和抗体Ｃ１７９。用Ａ／Ｏｋｕｄａ／５７Ｈ２Ｎ２）毒株免疫小鼠后，通过杂交瘤细胞技术获得（了单克隆抗体Ｃ１７９。通过免疫沉淀试验发现，单抗Ｃ１７９可识别病毒的ＨＡ，但它对甲型流感Ｈ１，Ｈ２和Ｈ３Ｈ种亚型的病毒并没有显示出血凝抑制活性。单抗Ｃ１７９能中和甲型流感病毒的Ｈ１和Ｈ２亚型。该单克隆抗体可识别所有Ｈ１和Ｈ２－流感病毒ＨＡ茎部上保守区域的两个抗原表位构象，ＨＡ１亚基上的３１８３２２氨基ＨＡ４７－５８２亚氨基酸残基，酸残基Ｗ及基上的。在后期低ｐＨ值的环境下单抗Ｃ，，１７９可结合到ＨＡ的茎部并抑制ＨＡ的融合活性从而阻止病毒与细胞融合。１７、因此中和病毒活性在随后的几年内发现，单抗Ｃ９可识别甲型流感的Ｈ５Ｈ６和Ｈ９。单抗Ｃ１７９能中和Ｈ５亚型的病毒，但不能中和Ｈ６亚型的病毒，单抗１７Ｃ１７９只与能Ｈ６亚型的ＨＡ发生免疫沉淀反应。最近，通过单抗Ｃ９与Ｈ２亚型ＨＡ的复合体晶体结构的Ｘ射线分析证实了单抗Ｃ１７９的中和机制＋２００８年，Ｔｈｒｏｓｂｙ等人采用人ＩｇＭ记忆Ｂ细胞隨菌体文库技术，分离到了１３株人源单克隆抗体。送些单抗可识别Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、—Ｈ１７９１３和Ｈ１６，但中和活性程度有所不同的。这些抗体与单抗Ｃ样不具有血凝抑制活性。而其中单向靴标单克隆抗体ＣＲ６２６１是最有效的抗体。在ＭＤＣＫ细胞微量中和试验结果表明，单抗ＣＲ抗６１对Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８和Ｈ９亚－型的流感病毒具有中和活性。单抗ＣＲ６２６１的结合是由ＨＣＤＲ１３和框架区３的，它可识别茎部ＨＡ１／ＨＡ２上膜近端高度保守的螺旋区域重链介导的，该抗体通过狙断与膜諫合相关的构象重排Ｗ中和病毒。ＣＲ６２６１中和作用的广度大部分取ｓＡ［ｗ＂决于ｓｎ３８是否存在糖基化。２００９年，Ｓ山等人利用人源抗体隨菌体展示库和Ｈ５血凝素胞外结构域，筛一选出了０。其中１株针对第１组流感病毒具有广谱效应的中和单克隆抗体个单克隆抗体与Ｈ５Ｎ１的ＨＡ结合的晶体结构显示，该单抗仅使用重链的Ｈ个ＣＤ民。与ＨＡ茎部区域的高度保守位点相结合，抑制膜融合所需的构像变化这些单抗的结构基本相似，均由六个不同的Ｖｈ（重链可变区）片段和七个不同的Ｖｌ（轻链可变区）片段结合组成。送１０株单抗能识别病毒上相似的表位。Ｆ１０便一－是其中的种。ＦｌＯＩｇＧｌ能中和Ｈ５、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ６和Ｈ１１型的假病毒感染。通过微量中和分析，Ｆ１０能中和Ｈ５ＮＫＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ８Ｎ４和Ｈ９Ｎ２亚型的流感病毒。事实上，许多表位残基，特别是在ＨＡ２区域中，在所８２１１有１６种ＨＡ亚型中基本上都是高度保守的。２０１１年，Ｅｋｉｅｒｔ等人年发现了单克隆抗体ＣＲ８０２０，该抗体主要针对第２组１１ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定１，组的流感病毒。微量中和试验结果表明的流感病毒但不能中和第，单抗ＣＲ８０２０对Ｈ３、Ｈ７和Ｈ１０亚型的病毒的具有中和活性，并可结合Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４和Ｈ１５亚型的ＨＡ。单抗Ｃ民８０２０的Ｆａｂ片段结合在ＨＡ茎基部接近病毒膜的地方，其结合部位比迄今为止所知道的任何其他流感抗体都要低。单抗ＣＲ８０２０通过隔离融合肤阻止ＨＡ的构象变化。此外，单抗ＣＲ８０２０还可与ＨＡ０结合并抑制ＨＡ１和ＨＡ２的成熟，在空间上防止宿主蛋白酶裂解ＨＡ０。相较于单抗ＣＲ６２６１和Ｆ１０，单抗ＣＲ８０２０识别其表位更传统的方式，是同时使用重链和捏链来识别抗原表位的。该表位是整个组２病毒的高度保守区域，该表位由两个－部分组成５－））：１）茎基部附近链的ｅ片层的最外链（ＨＡ２残基３０３６２；融－合肤的Ｃ末端部分（ＨＡ２残基１５１９），及其周边的部分残基。总而言之，ＣＲ８０２０识别的表位的核也在整个组２的ＨＡ上是高度保守的，而其他多变的残基对抗体的结合影响不大，且单抗ＣＲ８０２０对这些残基的耐受性较好综上所述，单克隆抗体Ｃ１７９、ＣＲ６２６１和Ｆ１０都是第１组甲型流感病毒的广谱中和抗体。单抗ＣＲ６２６１和Ｆ１０均可识别ＨＡ茎部区域高度保守的表位。该ＨＡ２的Ａ一些残基组成表位主要由螺旋和ＨＡ１的。主要的反应是ＨＣＤＲ１与螺旋Ａ之间的结合，ＨＣＤＲ２与螺旋Ａ附近的ＨＡ１上的疏水区域相结合，ＨＣＤＲ３与螺旋Ａ下部部分区域相结合，而框架３与螺旋Ａ上部部分区域相结合。两种２一抗体不与组的Ｈ３，Ｈ７和Ｈ１０发生交叉反应，送主要是由于Ａｓｎ３８上存在一一个高度保守的糖链，它是表位的部分，通过重链Ｗ及些其他组特异性的残基连接的。另外，ＨＣＤＲ２与ＨＡ１上的耐２１相结合，但这部分在组２上的构象与８１［】１ＤＲ２组不同，它不能够与ＨＣ相结合。ＨＡ－１上Ｎ连接糖基化的Ａｓｎ３８在大多数组２病毒中有可能限制组１抗体与该表位结合。单抗ＣＲ６２６１和ＣＲ８０２０识别的表位间只有两个残基是保守的，但单抗ＣＲ８０２０不中和组１中的病毒。更具体地说，组１病毒Ａｓｎ２１上的保守聚糖利用空间位阻阻止与ＨＣＤＲ１结合。同样的，大多数组１病毒的第３４位保守酪ｓｓＨＣＤＲｔｉ氨酸残基会与３发生冲突。２．３甲型流感病毒的通用流感抗体对于用于流感治疗的抗体，能中和所有甲型流感毒株的强效广谱抗体是研究的终极目标，ＦＩＲ９１１４１。通过试验发现两种抗体６和Ｃ能中和所有第组和第２组的流感病毒２０１２年，Ｄｒｅｙｆｕｓ等人通过组合展示文库回收到了３种免疫球蛋白（ＩＧ），ｇ其中抗体ＣＲ９１１４可中和组１和组２的甲型流感病毒。单抗ＣＲ９１１４与ＣＲ６％１和ＣＲ８０２０相竞争，因此ＣＲ９Ｈ４也可识别ＨＡ茎部。抗体ＣＲ９１１４与ＨＡ茎部结合的表位化及结合方式都与ＣＲ６２６１相似。虽然单抗ＣＲ９１１４与ＣＲ６２１２均来１２ 流感病毒中和抗体的研究进展－Ｖ基因ＨＡ的方式略有不同自于Ｖｈ１６９种系的，但它们识别。在体外通过微量９１１４可Ｈ１－Ｈ５、Ｈ７ＨＨ１０、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１５中和试验发现，单抗ＣＲ结合和９、ＨＡ－Ｈ和Ｈ１６亚型病毒的，能中和Ｈ１１２Ｗ及Ｈ１４亚型病毒。ＣＲ９１１通过阻止＾４１ｐＨ诱导的ＨＡ与膜融合有关的的构象变化Ｗ产生中合作用。２００９年爆发Ｈ１Ｎ１大流行后，Ｃｏｒｔｉ等人从８个捐献者提供的１０４０００个浆细胞中筛选出了部分能对Ｈ５和Ｈ７产生交叉保护的抗体。从浆细胞产生的Ｈ／Ｈ５／Ｈ７产（Ｖ）和Ｋ轻链（Ｖ）的１生交叉反应抗体中获得的免疫球蛋白重链ｈｋ一＊巧６。巧６是由Ｖ３－３０可变区序列是相同的。该序列编码的类抗体称为ｈ１８和＊－Ｖ４１０１组成３（ＨＣＤＲ３）有２２。单抗Ｆ１６可ｋ，其重链互补决定区个氨基酸识别ＨＡ的Ｆ子域，ＦＩ６可抑制合胞体的形成，但不发生血凝抑制反应，能与Ｆ１０发生竞争结合ＦＩ６可识别融合，Ｗ及组１和组２亚型ＨＡ的螺旋。单抗化的残基ＡＡ的螺旋Ａ－。此外与Ｆ１６化同源细胞系相关的，但不能识别乙型流感病毒Ｈ抗体ＦＩ３７０也可Ｗ与ＨＡ１和ＨＡ２的ＨＡＳ相结合，并具有中和作用。Ｆ１６的变体８５Ｆｔ］Ｉ６Ｖ３可通过ＴＰＣＫ膜蛋白酶处理后可抑制ＨＡ０的裂解。２１ＦＨＡ中在组１的ＨＡ中，Ｔｒｐ是大致与子域的表面相平行，而在组２的，°止组间交叉反应它大致与Ｆ子域面相垂直，旋转了大约９０，，该差异可Ｗ阻而ＣＲ９１１４和ＦＩ６ｖ３能够适应Ｔｒｐ２１构象的细微差别。类似于ＣＲ９１１４，ＦＩ６ｖ３能够位移Ａｓｎ３８上的保守聚糖，避免与组２ＨＡ发生空间冲突。值得注意的是，ＣＲ９１１４抗原表位在甲型流感和乙型流感之间是保守的。电子显微镜重建显示，ＣＲ９１１４类似地结合和识别乙型流感ＨＡ的茎轩部分。在这方面看，ＣＲ９１１４是迄Ｍ一ｔｌ今为止己知的唯通用的流感抗体。除了上述的广谱抗体Ｗ外还有其他多种类型的单克隆抗体。ＨＡ组１和ＨＡ８６［ｊ组２的广谱抗体除了上述的单抗Ｗ外还有单克隆抗体２Ｇ０２。拟Ｎ２亚型的广８７［］－－－２６４４２７Ｈ１、Ｈ２、谱抗体还有Ｆ００５１。而单克隆抗体Ｆ０５０９２和Ｆ０２６可中和８ｗｗＨＨ［ｆ’ｉ３和５亚型流感病毒＼人源抗体５Ｊ８具有Ｈ１Ｎ１亚型的广谱中和活性。最近还发现了Ｈ５Ｎ１亚型的广谱抗体Ｍ５Ｎ９，它可识别Ｈ５Ｎ１上包含ＶＥ区域的ｔＷ保守表位。而为了发展临床应用型治疗抗体，最近研发了针对高致病性禽流９２［１感Ｈ５Ｎ１的人鼠嵌合型单克隆抗体ＣＨ６１。３乙型流感病毒的广谱中和抗体每年造成流感流行的流感病毒主要有Ｈ１、Ｈ３和乙型。而有时每年流感流行的主要原因是由于艺型流感病毒两个谱系共同流行造成的。２０１２年Ｄｒｅｙｆｏｓ等人发现单克隆抗体ＣＲ９１１４的同时也发现了单克隆抗体－－－ＣＲ８０３３，ＣＲ８０７１。单克隆抗体ＣＲ８０３３（Ｖｈ３９、Ｖ，３２０）和ＣＲ８０７１（Ｖｈ１１８、１３ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定－乙型流感病毒的两个谱系Ｖｘ１４７）可结合。ＣＲ９１１４在体外试验中不能中和乙型一一流感病毒。但动物实验表明，该抗体能对定量感染的动物起到保护作用。进步研究表明，ＣＲ９１１４能与甲型流感Ｈ１、Ｈ３、Ｈ７和Ｈ９亚型及乙型流感病毒产生交叉反应。经分析，而ＣＲ８０７１、ＣＲ８０３３与ＣＲ９１１４均识别ＨＡ上不同的区域。ＣＲ８０３３的三个Ｆａｂ片段结合ＨＡ上与受体结合位点及周围抗原位点相重叠的抗原表位。电磁模型表明，几乎所有的联接都是使用Ｈ个ＨＣＤ艮环和框架３通过Ｖｈ联接的。乙型流感病毒ＨＡ上的该区域超过９８％是保守的，并且其受体。ＣＲ８０７１ＨＡ结合位点是很保守的，但受体结合位点的周围区域是多变的结合，距头底部的残留醋酶结构域离受体结合位点很遥远，该结构与其不发生血凝抑一制的结果相致。ＣＲ９１１４识别的表位在甲型流感病毒和乙型流感病毒上是高度保守的。培养２０代内，Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６病毒没有产生能逃避ＣＲ８０３３中和效应的变异株，但１５代时Ｌｙｓ３８会突变为Ｇ山，Ｔｙｒ４０突变为Ｈｉｓ，这样会降低ＣＲ８０７１的敏感性ａｌａｓｉａ／２５０６／２００４５。Ｂ／Ｍｙ病毒培养１代后会产生Ｐｒｏｌ６１突变为Ｇｉｎ的变异，该变异会降低ＣＲ８０３３的敏感性，而利用ＣＲ８０７１培养病毒２０代也不会产生能逃避中和抗体的变异株。单抗ＣＲ８０７１和ＣＲ８０３３似乎是通过阻止子代病毒的释放来Ｗ产生中和活性，其作用扎那米韦针对ＮＡ的作用非常相似。单抗ＣＲ８ＣＢ３对Ｙａｍａｇａｔａ系具有血凝抑制活性，但对Ｖｉｃｔｏｒｉａ系不具有血凝抑制活性。单抗ＣＲ８０３３通过阻断受体结合来中和Ｙａｍａｇａｔａ系，而单抗ＣＲ８０７１对乙型流８４［］感病毒的两个系都不具有血凝抑制活性。４ＮＡ中和抗体的简述除了针对ＨＡ的单克隆抗体外还有针对ＮＡ的单克隆抗体。由于耐药毒株的一个较好的选择出现，使得抗ＮＡ单克隆抗体成为了。试验证明，ＮＡ单抗也可ｔｗｉ。５Ｎ１亚型ＮＡ结合的抗体Ｎ－ＶＨＨｍ、Ｗ针对流感病毒的感染产生保护Ｈｌ［９４刈Ｎ－－ｌＶＨＨｂ、２Ｂ９等可预防Ｈ５Ｎ１感染。单克隆抗体ｈＣＡ２可Ｗ抑吿ｓ！Ｉ所有ＮＡ的活性，并且能抑制ＮＡＩ耐药的己型流感病毒的复制并在最近发现了六组９６［１鼠源ＮＡ单克隆抗体不仅对Ｈ１Ｎ１有效也对Ｈ５Ｎ１有效。５国内流感病毒广谱中和抗体的硏究进展２００７年，方钟等人通过杂交瘤细胞技术制备了多株针对ＨＡ的鼠源单克隆抗体，其中单克隆抗体１０巧对３４株Ｈ５Ｎ１病毒株都具有血凝抑制活性Ｗ及中和活性。随后他们通过小分子抗体技术将单克隆抗体１０巧改造成具有较好活性和（ｓｔ特异性的单链抗体ｉｎｇｌｅｄｉａｉｎａｎｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）。１０Ｆ７ｓｃＦｖ仍对Ｈ５Ｎ１亚型的流感病毒具有血凝抑制活性Ｗ及亚型内的广谱中和活性１４ 流感病毒中和抗体的研究进展２０１１年张晓等人发现了两株Ｈ５Ｎ１亚型流感病毒的广谱抗体８Ｇ１０Ｄ７和４Ｆ５。不同的是单克隆抗体８Ｇ１０Ｄ７属于鼠源单克隆抗体而单克隆抗体４Ｆ５属于１Ｄ７单链抗体。抗体８Ｇ０还具有血凝抑制活性，因此该抗体所识别的表位位于ＨＡ的ＨＡ—４Ｆ１上。与抗体８Ｇ１０Ｄ７样，抗体５所识别的表位也位于ＨＡ头部，但抗体４Ｆ５所识别的表位为（７６）ＷＬＬＧＮＰ（８１）序列及其保守的疏水残基过基因重组技术构建了一２０１４年，义ｏｎｇ等人通个新型人鼠嵌合抗体曲５Ｍ９。抗体ｈＨ５Ｍ９是将鼠源单克隆抗体Ｈ５Ｍ９的ＣＤＲｓ直接与人源抗体Ｆ化０Ｘ１０８的重链和轻链的可变区相结合。巧体ｈＨ５Ｍ９可中和多株Ｈ５Ｎ１亚型一的流感病毒，并具有血凝抑制活牲。该抗体可识别Ｈ５Ｎ１ＨＡ１上的个线性表－２４位２３４１，１，该表位位于Ｈ５亚型的氨基酸的位置。更有试验表明该表位在Ｈ５Ｎ胃亚型的毒株中较为保守。因此抗体ｈＨ５Ｍ９是Ｈ５Ｎ１亚型内的广谱单克隆抗体。２０１４年Ｗｕ等人通过杂交瘤技术获得了两株单克隆抗体ＨＡｂ０２和ＨＡｂ２１。单克隆抗体ＨＡｂ２１对不同株Ｈ５Ｎ１亚型的流感病毒具有中和活性Ｗ及血凝抑制活性，但单克隆抗体ＨＡｂ０２在血凝抑制试验Ｗ及微量中和中并未表现出任何有效活性。结果显示单克隆抗体ＨＡｂ２１是Ｈ５Ｎ１亚型流感病毒的广谱单克隆抗体。实验表明，抗体ＨＡｂ２１通过狙止病毒与受体结合而产生中合作用。与其结果相一５Ｎ一致，该抗抗体可识别Ｈ１亚型ＨＡ头部的个新型的构象依赖性表位，该表位与受体结合位点重叠。他们通过分析大量Ｈ５Ｎ１亚型ＨＡ的序列发现，该表位的氨基酸在许多Ｈ５Ｎ１分化体及亚分化体中高度保守，尤其在未发生变异的ＵＷＨ５Ｎ１毒株中高度保守。２０１４年Ｈｕｏ等人利用２００９大流行的Ｈ１Ｎ１疫苗溶解产物中的ＨＡ蛋白和季节性流感Ｈ１Ｎ１疫苗的ＨＡ蛋白部分免疫小鼠，获得了８４株鼠源单克隆抗体。其中２４％的单克隆抗体可识别在季节性流感Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２Ｗ及２００９大流行Ｈ１Ｎ１毒株上的保守抗原表位。其中有２５株单克隆抗体可识别Ｈ５Ｎ１亚型、Ｈ９Ｎ２亚型、季节性流感Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２及２００９大流行Ｈ１Ｎ１流感病毒上的保守表化其中的１６株具有血凝抑制活性。Ｗ上的试验结果表明，在Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２亚型的流感病毒ＨＡ上有一Ｈ２１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１和Ｈ９Ｎ个共同的保守表位，在亚型的ＨＡ上有一个共同的保守表位。随后通过免疫组化试验，他们发现流感病毒ＨＡ蛋白与人类的脑组织及膜腺具有异嗜性抗原表位上述单克隆抗体１０Ｆ７、８Ｇ１０Ｄ７、４Ｆ５、ｈＨ５Ｍ９和ＨＡｂ２１均为Ｈ５Ｎ１亚型的广谱单克隆抗体，且这抗体识别的表位均位于ＨＡ头部。除了针对ＨＡ的单克隆ｉＰ２［Ｗ抗体外，还有人还发现了针对甲型流感病毒Ｎ蛋白的单克隆抗体４Ｄ。１５ 总结与展望总结与展望由于耐药毒株的出现Ｗ及普通流感疫苗制备的各种问题，使得新的抗病毒制剂的研发与制备变得尤为迫切。而广谱中和抗体的研究发现为利用抗体治疗流感提供了新的途径。广谱中和抗体具有明显的优势，其广谱性和交叉反应性显示这类抗体可Ｗ作为新的抗病毒方式。，来抵抗现在或将来可能流行的流感病毒广谱单克隆抗体还可用于保守抗原表位的研究，通用疫苗的开发Ｗ及与ＮＡ抑制剂联合使用避免耐药毒株的产生等，也可用于基础免疫治疗Ｗ及基础研究等。随着对流感病毒广谱抗体的深入研究，出现了很多针对其主要抗原蛋白的各种单克隆抗体，此类研究的成果多数用于研制疫苗和研究未来新型抗病毒药。但目前制备疫苗仍有部分问题没有解决，如疫苗的研制时间长；如何引起有效而持久的免疫应答；疫苗制造应用前，基于动物试验的基础上，如何能够更好地预测评估人体对于该疫苗的免疫应答等。流感病毒的ＨＡ和ＮＡ蛋白的某些保守部位是抗病毒药物及中和抗体的主要郎标，为了逃避抗体和药物造成的选择压力，流感病毒在进化过程中，逐渐通过糖基化或者其他化学修饰来保护这些髙度保守区域免受抗体或药物攻击。，逸将对未来抗体和药物研究带来新的挑战－ｉ＜？—１７ 参考文献参考文献［ＵＬｅｄｆｏｒｄＨ．Ｉｓａｕｎｉｖｅｒｓａｌｆｌｕｖａｃｃｉｎｅ０打ｉｔｓｗａｙ？＂？Ｎａｔｕｒｅ，２００８Ｊａｎｕａｒｙ７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｅｗｓ．２００８４１０．，［２］ＯｚａｗａＭ，ＫａｗａｏｋａＹ．ＣｒｏｓｓｔａｌｋｂｅｔｗｅｅｎａｎｉｍａｌａｎｄｈｕｍａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓｅｓＪ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．［］ＡｎＬ－ｉｍ．Ｂｉｏｓｃ２０１３１１：２１４２．，，（）３ＮａｂｅｌＧＪＷｅｉＣＪＬｅｄｅｒｗｏｏｄＪＥ．ＶａｃｃｉｎａｔｅｆｏｒｔｈｅｎｅｘｔＨ２Ｎ２ａｎｄｅｍｉｃｎｏｗ．Ｎｔ［］，阴ａｕｒｅ，，ｇｐ２０－１１４７１７３３７：１５７１５８．，（）４ＬａｍｂｅｒｔＬＣＦａｕｃｉＡＳ．ＩｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｓｆｏｒｔｈｅｆｉｉｔｕｒｅＪ．ＮｅｗＥｎｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆ，［］［］ｇｄ－Ｍｅｉｃｉｎｅ２０１０３巧２１：２０３６２０４４．，，（）口ｈｏｕＪ，ＷａｎＤ，Ｇａｏ氏巧ａｌ．ＢｉｏｌｏｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｎｏｖｅｌａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＡＨ７Ｎ９ｖｉｒｕｓＪ．］Ｚｇｇ（）［］Ｎａ－ｔｕｒｅ２０１３４９９７４巧：５００５０３．，，（）６Ｇ－ａｍｂｌｉｎＳＪ，ＳｋｅｈｅｌＪＪ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｈｅｍａｈｉｔｉｎｉ打ａｎｄ打ｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｍｅｍｂｒａｎｅ［］ｇｇ－ｌｃｏｒｏｔｅｉｎｓ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ，２０１０２８５７：２８４０３２８４０９．ｇｙｐ口ｇｙ，口）［７］ＢａｒｒＩ巧艮ｕｓｓｅｌｌＣ，Ｂ巧ｓｅｌａａｒＴＧｅｔａｌ．ＷＨＯｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓｆｏｒ化ｅｖｉｒｕｓｅｓｕｓｅｄｉｎ化ｅ２０１３－２０１４ＮｏｒｔｈｅｒｎＨｅｍｉｓｈｅｒｅｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅ：Ｅｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｔｉｅｎｉｃａｎｄｔｐｐｇｙ，ｇｇｅｎｅｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ（ＨＩＷ）ｐｄｍ０９，Ａ（Ｈ３Ｎ２）ａｎｄＢｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＯｃ２０－ｔｏｂｅｒ２０１２化Ｊａｎｕａｉ２０１３Ｊ．Ｖａｃｃｉｎｅ１４３２３７：４７１３４７２５－ｙ，，［］（）脚Ｗｅｂｓｔｅｒ民ＱＢｅａｎＷＪ，ＧｏｒｍａｎＯＴ，ｅｔａｌ．ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｃｏｌｏｇｙｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓ…．－Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｉｃａｌｒｅｖｉｅｗｓ１９９２５６１：１５２１７９．ｇ，，（）ｈｅｎＷＣａｌｖｏＰＡＭａｌｉｄｅＤｅｔａｌ．ＡｎｏｖｅｌｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｍｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｒｏｔｅｉｎｔｈａｔ巧］Ｃ，，，ｐ－ｉｎｄｕｃｅｓｃｅｌｌｄｅａｔｈ？ＩＳｆａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ２００１７１２：１３０６１３１２．…，，（）ｏ－１０ＭｃＡｕｌｅｙＪＬＣｈｉｕｋＪＥ，呂ｙｄＫＬｅｔａｌ．ＰＢ１Ｆ２ｒｏｔｅｉ打ｓｆｒｏｍＨ５Ｎ１ａｎｄ２０ｔｈｃｅｎｔｕｒ［］ｐ，ｐｙａｎｄｅｍｉｃｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃａｕｓｅｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏ軟［Ｊ．ＰＬｏＳａｔｈｏｅ打ｓ，２０１０６７：ｅｌ００１０１４．ｐ］ｐｇ，（）ＷｒｉｇｈｔＰＦ，ＮｅｕｍａｎｎＱＫａｗａｏｋａＹ．Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ．２００７…．ＦｉｅｌｄｓＶｉｒｏｌｏｇｙ，５ｔｈ－４０ｄｉｔｉｏｎＬｉｉｔｔＡ＾＾ｌｌｉａ＆Ａ＾＾ｌｋｉ１６９２１７．Ｅ：ｐｐｎｃｏｍｓｎｓ，＂Ｈ＂１ｅｉｄＡＨＦａｎｎｉｎｕｌｔｉ打Ｊｔａｌ．Ｏｒｉｉｎａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｏｆｔｈｅ１９１８Ｓ［巧Ｒ，ｇ了Ｇ乂ｅｇ打ｐａｎｉｓｈｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｅｎｅＪ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ９ｇｇｇ［］ｇ，１９９ｙ，９６４：１６５Ｍ６５６．（）－３ＫａｗａｏｋａＹＫｒａｕｓｓＳ－Ｗｅｂｓｔｅｒ民ＱＡｖｉａｎｔｏｈｕｍ抑ｔｒａｎｓｍｉ巧ｉｏｎｏｆｔｈｅＰＢ。］ｊ，ｌｇｅｎｅｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓｉｎｔｈｅ１９５７ａｎｄ１９６８ａｎｄｅｉｎｉｃｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ１９８６３ｐ［］ｇｙ，乂。１）：４６０３－４６０８．［１４］ＣｏｌｅｍａｎＭＴ，ＤｏｗｄｌｅＷＲ，ＰｅｒｅｉｒａＨＱｅｔａｌ．ＴｈｅＨｏｎｇＫｏｎｇ／６８ｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ２ｖａｒｉａｎｔ［Ｊ］，Ｔｈ－ｅＬａｎｅ１９６８２巧７５８３１３珠：８４１３８６．，（）１９ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定ｌａｒｔｅｎ民Ｊ，ＤａｖｉｓＣＴ，民ＵＳ化１１ＣＡ，巧ａｌ．Ａｎｔｉｅｎｉｃａｎｄｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ［ｙＧｇｇ－ｈｓｗｉｎｅｏｒｉｉｎ２００９ＡＨｌＮｌｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｉｎｕｉｎａｎｓ．ｓｃｉｅ打ｃｅ２００９３２５５巧７：ｇ，，（）ｇｔｎ（）－１９７２０１．１ＫｅｎｄａｌＡＰＮｏｂｌｅＧＳｋｅｈｅｌＪＪｅｔａｌ．ＡｎｔｉｅｎｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡＩＮｖｉ［，，ｒｕｓｅｓ巧氏ｇｙ巧。＂＂ｆｒｏｍｉｄｅｍｉｃｓｈ９７７－化Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎｔｒｉｉｓｌｔｉｉｄｉ９５０－ｉ１１９７８ｓａｎｓｏａｅｄｎｅｅｍｃｓｏｆ１１９５１．巧ｐ…Ｖ９７８８９２６３２－６３６ｉｒｏｌｏ１：．ｇｙ，，（）。７］ＮａｋａｊｉｍａＫ，ＤｅｓｓｅｌｂｅｉｇｅｒｉＵ，ＰａｌｅｓｅｉＲＲｅｃｅｎｔｈｕｍａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ（ＨｌＮｌ）ｖｉｒｕｓｅｓａｒｅ－ｃｌｏｓｅｌｒｅｌａｔｅｄｅ打ｅｔｉｃａｌｌｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｉｎ１９５０Ｊ，Ｎａｔｕｒｅ１９７８２７４５６６９：巧４３巧．ｙ，，ｇｙ化［］（）８ＧａｍｂａｒａｎＡＳＴｕｚ－－ｉｋｏｖＡＢＰｉｓｋａｒｅｖＶＥｅｔａｌ．Ｓｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｅｔｏｒｂｉｎｄｉｎ口，，，］ｙｐｐｇｈｅｎｏ－ｐｔｙｐｅｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓ置ｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍ出ｆｅｒｅｎｔｈｏｓｔｓｕｓｉｎｇｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓｉａｌｙｌｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：－－－ｔｅｄｈｕｍａｎａｎｄＨ３ｎｏｎｅａｄａｐＨＩｉｎｆｌｕｅｎｚａＡａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｚａＢｖｉｒｕｓｅｓｓｈａｒｅａｃｏｍｍｏｎｈｉｈｇｇｇ＇－－ｂｉｎｄ她ｎｉｔ－－ｉｎｆｏｒ６ｓｉａｌｌＮａｃｅｔｌＩａｃｔｏｓａｍｉｉｅＪＶｉｒｏｌｏ１９９７２３２２３４５３５（）ｇｙｙ（ｙｉ）［］．ｇｙ，，（）：．ＳａｕｔｅｒＮＫ，ＢｅｄｎａｒｓｋｉＭ０，ＷｕｒｚｂｕｒｇＢＡ，巧ａｌ．Ｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｓｆｒｏｍｔｗｏｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓｇｇ－ｖａｒｉａｎｔｓｂｉｎｄ化ｓｉａｌｉｃａｃｉｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｗｉｔｈｎｄｌｌｉｍｏｌａｒｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏ打ｃｏｎｓｔａｎｔｓ：ａ５００ＭＨｚｒｏｔｏｎｐ－打ｕｃｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｃ巧ｓｏｎａｎｃｅｓｔｕｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ１９８２８１：８３８８８３９６．ｙｔｎｙ，乂口）２０ＴＡＫＥＭＯＴＯＤＫ，ＳＫＥＨＥＬＪＪ，ＷＩＬＥＹＤＯＮＣ，Ａｓｕｒｆａｃｅｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅａｓｓａｆｏｒｔｈｅ［］ｐｙｂｉｎｄｉｎｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎ化ｉｔｓｓｉａｌｉｃａｃｉｄｒｅｃｅｔｏｒＪ．Ｖｉｒｏｌｏ１９９６２１７２ｇｇｇｐ［］ｇｙ，，（）：４５２－４５８．口Ｉ］Ｐａｌｅｓｅ巧ＴｏｂｉｔａＫ，ＵｅｄａＭ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ￣ｍｕｔａｎｔｓｄｅｆｅｃｔｉｖｅｉｎｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅＷ．Ｗｒｏｋ），１９７４６１２：３９７４１０．ｇｙ，（）２２］ＬｉｕＣＥｉｃｈｅｌｂｅｒｅｒＭＣＣｏｍａｎｓ民Ｗ，ｅｔａｌ．ＩｎｆｌｕｅｎｚａｔｅＡｖｉｍｓｎｅｕｒａｍｉ打ｉｄａｓｅｄｏｅｓｎｏｔ［，ｇ，ｐｙｐｉｌｔｒｌｉｉｂｌｂｌｌ９５ｌａａｒｏｌｅｉｎｖｒａｅｎｒｅｃａｔｏｎａｓｓｅｍｏｒｕｄｄｉｎＪ．ＪｏｕｒｎａｏｆＷｏｏ１９６９２：ｐｙｙ，ｐ，ｙ，ｇ［］ｇｙ，，（）－１０９９１１０６．ｚｄｚａｎｏｗ＿？２３ＧｅｒｈａｒｄＷＭｏｓｋａＫＦｕｒｃｈｎ舟Ｍｅｔａｌ？民ｏｌｅｏｆｔｈｅＢｃｅｌｌＩ的ｏ打ｓｅｉｎｒｅｃｏｖｅｒｏｆ［］，，，ｐｙｍ－ｉｃｅｆｒｏｍｒｉｍａｒｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｉｃａｌｒｅｖｉｅｗｓ１９９７１５９１；９５１０３，，ｐｙ［］ｇ，（）［２４］ＣｏｌｍａｎＰＭ．Ｎｅｗａｎｔｉｖｉｒａｌｓａｎｄｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ…？Ａｎｎｕａｌｒｅｖｉｅｗｏｆｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，７８：９５－１１８．２５ＴｏｎＳＬｉＹＲｉｌｅｒＰｅｔａｌｉｉｎｃｔｌｉｎｅａｉｉｍｓｆｒｏｍｂａｔｓｖａｉｌ．ＡｄｓｔｅｏｆｎｆｌｕｅｎｚａＡｖＪ．［］ｇ，，，ｇ［］ｆ－ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｄｉｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ２０１２１０９１１：４２６９４２７４．ｇｙ，），（［２６］Ｔｏ打ｇＳ，Ｚｈｕ义ＬｉＹ，ｅｔａｌＮｅｗｗｏｒｌｄｂａｔｓｈａｒｂｏｒｄｉｖｅｒｓｅｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳａｔｈｏｅｎｓ２０１３９１０：ｅｌ００３６５７，ｐｇ，，（）口７］ＡｉｒＧＭ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｍｏｎｇｔｈｅｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｇｅｎｅｓｏｆ１２ｓｕｂｔｙｐ拉ｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａ＊Ａｖ－ｉｒｕｓ［Ｊ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｉｎｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９８１，７８２：７６巧７６４３．］ｇｙ＂）ｏｂｕｓａｗａＥａｍａＴＫａｔｏＨ巧ａｌａｒｉｓｏｎｏｆｃｏｍｌｅｔｅａｍｉｉｄｓｅＡｏ．Ｃｏｍｎｏａｃｕｅｎｃｅｓａｎｄ口巧Ｎ，ｙ，，ｐｐｑ２０ 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抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及巧步鉴定ｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ机．ＰＬｏＳａｔｈｏｅｎｓ，２０１３，９３：６１００３２２３．ｐｇ（）［４３］ＧａｒｔｅｎＷ，ＫｌｅｎｋＨＤ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ［Ｊ］，Ｔｒｅｎｄｓｉｎ－ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，７（３）：９９１００．４４ＳｔｅｉｎｈａｕｅｒＤＡ．Ｒｏｌｅｏｆｈｅｍａｌｕｔｉ打ｉ打ｃｌｅａｖｅｆｏｒｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＪ．［］ｇｇ嫂［］Ｖ－ｉｒｏｌｏｇ１９９９２５８１：１２０．ｙ，，（）－４５ＰｄｕｅＭＬＧａｒｃｉａＭＳＤｅｔａ．ｅｒｌＶｉｒｕｌｅｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｅｕｅｎｃｅｄｕｌｉｃａｔｉｏｎａｔｔｈｅ［］，，ｅｎｎｅ，ｑｐｈ４９－ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｏｆａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｗｋｕｓｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，（２）：１７３１８６．４Ｓｔｉｅ打ｅｋｅ－Ｇｂ巧［巧ｒ６Ａ，ＶｅＭ，Ａｎｌ化ｅｒＨ，ｅｔａｌ？虹ｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｗｉｔｈｍｕｌｔｉｂａｓｉｃｙｇｇｇ－ｃｌｅａｖａｅｓｉｔｅｉｓａｃｔｉｖａｔｅｄｂｆｉｉｒｉｎ泣ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｌｉｋｅｅｎｃｌｏｒｏｔｅａｓｅＪ．ＴｈｅＥＭＢＯｏｕｒｎａｌ１９９２ｇｙ，ｐ［］ｊ，，－１１７：２４０７２４１４．（）４７ＫｌｅｎｋＨＤ，ＲｏｔＲ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓａｔｈｏｅｎｉｃｉｔ？Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ［］ｇｙｐｇｙ…Ｒｅｓ－１９８８３４：２４７２８１．，，４８ＳｋｅｈｅｌＪＪＡ＾ｌｅＤＣ．Ｒｅｃｅｔｏｒｂｉｎｄｉｎａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｆｕｓｉｏｎｉｎｖｉｍｓｅｎｔｒ：ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｚａ［］，ｙｐｇｙｈｅｍａ－ｌｕｔｉｎｉｎＪ．Ａｎｎｕａｌｒｅｖｉｅｗｏｆｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ２０００６９：５３１５Ｗ．ｇｇ，，｜；］ｙ＂）４９Ｄ。ＡＭ－朝１巧ｌｓｏｎＩＡＳｋｅｈｅｌＪＪ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｂｉｎｄｉｎｓｉｔｅｓｏｆ［］，ｙｇＨｏｎｇＫｏｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｖｏｌｖｅｍｅ打ｔｉｎａｎｔｉｇｅｎｉｃｖａｒｉａｔｉｏ打抓Ｎａｔｕｒｅ，－１９８１２８９５７９６：３７３３７８．，（）口０ＵｎｄｅｒｗｏｏｄＰＡ．Ｍａｉｎｏｆａｎｔｉｅｎｉｃｃｈａｎｅｓｉｎｔｈｅｈａｅｍａｌｕｔｉ打ｉｎｏｆＨｏｎＫｏｎ］ｐｐｇｇｇｇｇｇｇｉｌｉｌｉｎｆｌｕｅｎｚａＨ３Ｎ２ｓｔｒａｎｓｕｓｉｎａｌａｒｇｅａｎｅｌｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａａｎｔｉｂｏｄｅｓＪ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｏｆｅｎｅｒａｌ（）ｇｐ［］ｇ－ｖｉｒｏｌｏ１９８２，６２：１５３１６９．ｇｙ，口。ＣａｔｏｎＡＪ，ＢｒｏｗｎｌｅｅＧ巧ＹｅｗｄｅｌｌＪＷ，ｅｔａｌ．ＴｈｅａｎｔｉｇｅｎｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＡ／ＰＲ／／３４－８ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＨＩｓｕｂｔｅ）．Ｃｅｌｌ１９８２３１２：４１７４２７．（ｙｐ饥，，（）－ＳａｌｚｂｅｒＳ．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔｈｅｓｒｉｎｇｅ？Ｎａｔｕｒｅ２００８４５４７２０１：１６０１６１．口巧ｇｙ…，，（）巧－５３ＨａＹＳｔｅｖｅ打ｓＤＪＳｋｅｈｅｌＪＪａｌ．ＸｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆＨ５ａｖｉａｎａｎｄＨ９ｓｗｉｎｅｉｎｆｌｕｅｎｚａ［］，，，ｙｖｉｒｕｓｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓｂｏｕｎｄｔｏａｖｉａｎａｎｄｈｕｍａｎｒｅｃｅｐｔｏｒａｎａｌｏｇｓ阴？Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ化ｅＮａｔｉｏｎａｌａｄｅｍｏｆ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ２０００１８１１８６．Ａｃｙ，１９８：１１１１，口）口４］ＷａｎｇＱ，ＣｈｅｎｇＦ，ＬｕＭ，ｅｔａｌ．ＣｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｕｎｌｉｇａｎｄｅｄｉｎｆｌｕｅｎｚａＢｖｉｒｕｓｈｅｍａ－ｌｕｔｉｎｉｎ．Ｊｏｕｍａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ２００８８２６：３０１１３０２０．ｇｇ，，｜７］ｇｙ（）ａｉｈｅｓｅＪＮＬａｖｅｒＷａｎＰＭ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓｌｃｏｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｅｎ口３Ｖｇ，ＱＣｏｌｍｇｙｐｇＪ－ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅａｔ２．９Ａｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ１９８３３０３５９１２：３５４０．［］，，（）口巧ＢｕｒｍｅｉｓｔｅｒＷＰ，Ｒｕｉｇｒｏｋ民Ｗ，ＣｕｓａｃｋＳ．Ｔｈｅ２．２ＡｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＢｎｅｕｒａｍ－ｉｎｉｄａｓｅａｎｄｉｔｓｃｏｍｌｅｘｗｉｔｈｓｉａｌｉｃａｃｉｄＪ．ＴｈｅＥＭＢＯｏｕｒｎａｌ１９９２１１１：４９５６．ｐ［］，，ｊ（）５７ＣｏｌｍａｎＰＭ，ＶａｉｈｅｓｅＪＮ，ＬａｖｅｒＷＧＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃａｔａｌｔｉｃａｎｄａｎｔｉｅｎｉｃｓｉｔｅｓｉｎ［］ｇｙｇ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．１ｖｉｒｕｓｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅＪＮａｔｕｒｅ９８３３０３：４１４４．［］，，２２ 参考文献＂＊ｋａｉｅｓｅＪＮＭｃＫｈｎｍＢｉｅｓｃｈｉｎＪＩＬＣａｌｄｗｅｌｌＪＢｅｔａｌ．Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃｏｍｌｅｘ口巧Ｖｇｈ，，，ｐｂｅｔｗｅｅｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅａｎｄｓｉａｌｉｃａｃｉｄｔｈｅｖｉｒａｌｒｅｃｅｔｏｒＪ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐ［］，－ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１９９２１４３：３２７３３２．，，，（）－５９ＶａｉｈｅｓｅＪＮＣｈａｎｄａｎａＥａＣｏｌｍａｎＰＭ．Ｔｈｒｅｅｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃｏｍｌｅｘ［］ｇ，ｐ乂ｐｏ－－ｆ４ｕａｎｉｄｉｎｏＮｅｕ５Ａｃ２ｅｎａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅＪ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓｃｉｅｎｃｅ１９９５４６：ｇ［］，，（）１０８Ｍ０８７．［６０］Ｒｕｓｓｅｌｌ民Ｊ，ＨａｉｒｅＬＦ，ＳｔｅｖｅｎｓＤｔｅｔａｌ．ＴｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＨ５Ｎ１ａｖｉ孤ｉｎｆｌｕｅｎｚａ＊ｎｅｕｒａｍｉｉｄａｓｅｓｕｅｓｔｓｎｅｗｏｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓｆｏｒｄｒｕｄｅｓｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ２００６４４３７１０７４５４乂ｎｇｇｇ阴，：ｐｐｇ，（）６Ｉｔｔｉ．Ｔｈｅａｒａａｉｎｓｔｉｎｆｌｕｅｎｚａｄｉｓｃｏａｎｄｄｅｌｏｅｎｔｏｆｓｉａｌｉｄａｓｅ［１］ｖｏｎｚｓｅｎＭｗｇ：ｖｅｒｙｖｅｐｍｉ－ｉｎｈｉｂｔｏｒｓｉｅｗｓＤｒｕｄｉｓｃｏｖｅｒ２００７６１２？Ｎａｔｕｒｅｒｅｖ：９巧９７４．…ｇｙ，，（）６２ＧｒａｖｅｌＣＬｉＣＪ巧ａｌｌｉｔｔｉｔｉｌｆｖｉｌｌｌｌｂｔＷａｎ．ｕａａｔｉｖｅａｎｄｕａｎａｔｖｅａｎａｓｅｓｏｒｔｕａａｓｕｅｓｏｆ［］，，ｇ，ＱｑｙｙｙｐｉｎｆｌｕｅｎｚａＡａｎｄＢｖｉｒａｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｓｕｓｉｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔａｉｅｔｉｎｔｈｅｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄｇ＾ｇｙｓｅｕｅｎｃｅｓＪ２８－．Ｖａｃｃｉｎｅ２０１０３６：巧７４５７８４．ｑ［］，，（）Ｍｅ巧ａｌＯｓｅ－６３ｅｒＡＬａｃｋｅｎｂＡＨｕｎｎｅｓＯｌｔａｍｉｖｉｒｒｅｓｉｓｔａｎｔｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＡＨｌＮｌ［］巧，ｙ，ｇ，（），＊Ｅｕｒｏｅ２００７－０８ｆｅｃ－ｓｅａｓｏｎＪ．Ｅｍｅｉｉｎｉｎｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ２００９１５４：５５２５６０．缉ｐ，［］ｇｇ，，（）＇—６４－ＢＭｃＫｉｍｍｉｅｓｃｈｋｉｎＪＬ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ化ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓａ［］；ｒｅｖｉｅｗＪ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌｒｅｓｅａｒｃｈ２０００４７ｌ：＾１７．，｜；］ｊ（）６ｌｉｃｋＴＪ，ＳａｈａｓｒａｂｕｄｈｅＡ，ＭｃＤｏｎａｌｄＭ，巧ａｌ．Ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ打ｏｆｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ抑ｄ［引Ｓｈｅｍａ－－Ｎｅｕ５Ａｃ２ｅｎｌｕｔｉｎｉｎｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏ４ｕａｎｉｄｉｎｏＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｇｇ［］ｇｙ，－１９９８２４６１９５１０３．，（）：［６６］ＷｈｉｔｌｅＪＲＲｊＺｈａｎｇ氏ＫｈｕｒａｎａＳ，ｅｔａｌ．Ｂｒｏａｄｌｙｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｈｕｍａｎ；孤ｔｉｂｏｄｙ化ａｔ－ｒｅｃｏｚｅｓ化ｅ巧ｃｅｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｏｃｋｅｔｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎＪ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅ如ｐｐｇｇ［ＪｇＮ－ａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ２０１１１０８４：１４２１６１４２２１．ｙ，，口）巧－６７ＳｃｈｍｉｄｔＡＱＸｕＨｈａｎＡＲａｌＰｒｅｃｏ打ｆｉｕｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉｅｎｂｉｎｄｉｎｓｉｔｅｄｕｒｉｎ［］，Ｋｊｇｇｇｇａｆｉｎｉｔｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆａｂｒｏａｄｌｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓａｎｔｉｂｏｄ［Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅｙｙｇｙ］ｇ－ＷＮａｔｌｄｅｍｉ０２６４．ｉｏｎａＡｃａｏｆＳｃｅｎｃｅｓ２０１３１１ｌ：２ｙ，，（）－６ｏｓｈｉｄａ氏ＩａｒａｓｈｉＭＯｚａｋｉＨｅｔａｌ．Ｏｏｓｓｒｏｔｅｃｔｉｖｅｏｔｅ打ｔｉａｌｏｆａｎｏｖｅｌｎｕｍｏｃｌｏｎａｌ［巧Ｙｇ，，ｐｐａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｒｅｃｔｅｄａａｉｎｓｔａｎｔｉｅｎｉｃｓｉｔｅＢｏｆｔｈｅｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓＪ．ＰＬｏＳｇｇｇｇ［］ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，２００乂５（３）：ｅｌ０００３５０．６９ＬｅｅＦＳ，ＹｏｓｈｉｄａＲｊＥｋｉｅｒｔＯ。巧ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｒｅｃｏｎｉｔｉｏｎｏｆ化ｅｉｎｆｌｕｅｎｚａ［］ｙｐｙｇｖｉｒｕｓｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｒｅｃｅｔｏｒｂｉｎｄｉｎｓｉｔｅｅｎｈａｎｃｅｄｂａｖｉｄｉｔＪ，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌｇｇｐｇｙｙ［］ｇＡｃａｄｅｍｏｆ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ２０１２１０９４２：１７０４０１７０４５．ｙ，，（）－７０ＥｋｉｅｒｔａｓｈａＫＳｔｅｅｌＪｅｔａｌ．ＣｒｏｓｓｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓｍｅｄｉａｔｅｄ口ＣＫＡ，［］，ｙｐ，ｂ－ａｓｉｎｌｅａｎｔｉｂｏｄｌｏｏ？Ｎａｔｕｒｅ，２０１２４８９７４１７：５２６５３２．ｙ机，）ｇｙｐ（２３ 抗流感病毒中巧性单克隆抗体的制备及初步鉴定［７１］ＨａｒｒｉｓＡ，ＣａｒｄｏｎｅＱＷｉｉＪｄｅｒＤＣ，巧ａｌ．ＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｐｌｅｉｏｍｏｒｐｈｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙｃｒｙｏｅｌｅｃｔｒｏｎｔｏｍｏｇｒａｐｈｙＪ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００６，１０３（５０：［］ｇｙ）－１９１２３１９１２７．Ｗｒａｍｍｅｒ－７２ｔＪＳｍｉｔｈＫＭｉｌｌｅｒＪ，ｅｔａｌ．Ｒａｉｄｃｌｏｎｉｎｇｏｆｈｉｈａｆｌ５ｎｉｔｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［］，，ｐｇｙ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａａｉｎｓｔｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＪ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００８４５３７１９５：６６７６７１．ｇ［，（）３Ｂｅ打ｊａｍｉｎＥ，ＷａｎＷ，ＭｃＡｕｌｉ游ＪＭ，巧ａｌ．Ａｂｒｏａｄｌｙｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ１７］ｇａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｒｅｃｔｅｄａａｉｎｓｔａｎｏｖｅｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄｅｉｔｏｅｏｎｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＨ３ｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｇｐｐｇｇ－ｌｏｂｕｌｗｈｅａｄｐ］．ＪｏｕｍａＩｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１４８８１２：６７４３６７５０．ｇ，（）ＮＰａｋＳｅ－［７４ＮａｋａｍｕｒａＱＣｈａｉ，ｒ，ｔａｌ．Ａｎｉｎｖｉｖｏｈｕｍａｎｐｌａｓｍａｂｌａｓｔｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｔｅｃｈｎｉｕｅ］ｑａｌｌｏｗｓｒａｐｉｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｎｆｌｕｅｎｚａＡａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌｈｏｓｔ皮ｍｉｃｒｏｂｅ，２０１３，１４－（１）：９３１０３．７ｓ－［引ＫｏｕｄｔａａｉＷＫｏｌｄｉｋＭＨＢｒａｋｅｎｈｏｆＪＰ？！，ｅｔａｌ．Ｐｒｅａｎｄｏｓｔｅｘｏｓｕｒｅｕｓｅｏｆｈｕｍａｎ，ｊ，ｐｐｍｏｎｏｃｌｏ打ａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＨ５Ｎ１ａｎｄＨｌＮｌｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｍｉｃｅ：ｖｉａｂｌｅａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ化ｏｓｅ－ｌｔａｍｉｖｉｒ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ２００９２００口：１８７０１８７３．机，，（）６ＯｋｕｎｏＹＩｓｅａｗａＹＳａｓａｏＦｅｔａｌ．Ａｃｏｍｍｏｎｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｅｉｔｏｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ，，，１７］ｇｇｐｐｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓＨＩａｎｄＨ２ｓｔｒａｉｎｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ，１９９３，６７５：ｇｇ［］ｇｙ（）２５５２－２５５８．７７ＳｍｉｒｎｏｖＩＵＡＬｉａｔｏｖＡＳ，ＯｋｕｎｏＩ，ｅｔａｌ．ＡｃｏｍｍｏｎａｎｔｉｅｎｉｃｅｉｔｏｅｉｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ［］，ｐ［ｇｐｐｖｉｒｕｓＨＩＨ２Ｈ５Ｈ６ｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎＪ．Ｖｏｒｏｓｖｉｍｓｏｌｏｉｉ１９９９４４３：１１１５．（，，，）ｇｇ］［］ｐｙ，，ｇ（）７８ＳｍｉｒｎｏｖＹＡ，ＬｉａｔｏｖＡＳ，ＧｉｔｅｌｍａｎＡＫ，ｅｔａｌ．Ａｎｅｉｔｏｅｓｈａｒｅｄｂｔｈｅｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｓｏｆ［］ｐｐｐｙｇｇＨ－ＩＨ２Ｈ５ａｎｄＨ６ｓｕｂｔｅｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓ．Ａｃｔａｖｉｒｏｌｏｉｃａ＾１９９９，４３４：２巧２４４．，，，ｙｐ…ｇ（）９ＤｒｅｆｂｓｋｉｅｒｔＤ。Ｗｉｌｓｏ打ＩＡ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ江ｃｌａｓｓｉｃａｌｂｒｏａｄｌ打ｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｓｔｅｍａｎｔｉｂｏｄ１７］ｙ。ＥｙｇｙｉｎｃｏｍｌｅｘｗｉｔｈａａｎｄｅｍｉｃＨ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎＪ，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ２０１３ｐｐｇｇ［］ｇｙ，，８７－７１２７１４９１５４．（）：巧０］ＴｈｒｏｓｂｙＭ，ｖａｎｄｅ打ＢｒｉｎｋＥ，ＪｏｎｇｅｎｅｅｌｅｎＭ，ｅｔａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ－ｒｏｔｅｃｔａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｃｒｏｓｓｐｉｖｅａｇｍｎｓｔＨ５Ｎ１ａｎｄＨｌＮｌｒｅｃｏｖｅｒｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎＩｇＭ＋ｍｅｍｏｒｙＢｃｅ化？ＰｌｏＳｏｎｅ２００８３１２：ｅ３９４２．阴，，（）ｋｉｅｒｔＯＣＢｈａｂｈａ０［ｓｌｉｅｒＭＡｅｔａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｒｅｃｏｎｉｔｉｏｎｏｆａｈｉｈｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄ巧。Ｅ，Ｑｇ，ｙｇｇｙ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｉｔｏｅＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００３２４５９２４：２４６２５１．ｐｐ［］，乂（）ｔ－２ＳｕｉＪＨｗａｎＷＣＰｅｒｅｚ５ｅａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｆｉｍｃｔｉｏｎａｌｂａｓｅｓｆｏｒｂｒｏａｄｓｅｃｔｒｕｍ巧］，，，ｇｐｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｖｉａｎａｎｄｈｕｍａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓＪ．Ｎａｔｕｒｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏ［］ｇｙ，２００９－１６３：２６５２７３．，（）巧３］ＥｋｉｅｒｔＤＣＦｒｉｅｓｅ扛ＲＨＥ，ＢｈａｂｈａＱｅｔａｌ．Ａｈｉｈｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｅｉｔｏｅｏｎｒｏｕ，ｇｙｇｐｐｇｐ２－ｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１１３巧６０４４：８４３８５０，［］，，（）２４ 参考文献ｒｅｙｆｏｓ０ＬａｕｒｓｅｎＮＳＫｗａｋｓＴｅｔａｌ．ＨｉｈｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｉｔｏｅｓｏｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＢ巧刊Ｄ，，，ｇｙｐｐｐ－ｖｉｒｕｓｅｓＷ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７＾１００）：１３４３１３４８．ＪＧｂｆ巧５ＣｏｒｔｉＤＶｏｓｓ，ａｍｌｉｎＳＪ，ｔａｌ．Ａｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎａｎｔｉｂｏｄｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｌａｓｍａｃｅｌｌｓｔｈａｔ］，ｅｇｙｐｂ－ｉｎｄｓ！：〇ｒｏｕ１ａｎｄｒｏｕ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｓＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１１３３３０４４：８５０８５６．ｇｐｇｐｇｇ［］，，巧）巧旬ＬｉＧＭ，ＣｈｉｕＣ，ＷｒａｍｍｅｒｔＪ，ｅｔａｌ．ＰａｎｄｅｍｉｃＭＩＮＩｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｕｃｅｓａｒｅｃａｌｌ－ｒｅｓｏｎｓｅｉｎｈｕｍａｎｓｔｈａｔｆａｖｏｒｓｂｒｏａｄｌｙｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｅｍｅｍｏｒｙＢｃｅｌｌｓＪ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅｐ［］Ｎ－ａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，１０９２３：９０４７９０５２．ｙ（）巧７］Ｉｂａ乂Ｆｕｊ巧Ｙ，ＯｈｓｈｉｍａＮ，巧ａｌ．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｅｐｉｔｏｐｅａｔｇｌｏｂｕｌａｒｈｅａｄｏｆｚａ－ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｉｎＨ３Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｖｉｒｕｓｅｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ２０１４８８１３：７１３０７１４４．［］ｇｙ，，（）化ａ－８ｈｓｈｉｍａＮＹＫｕｂｏｔａＫｏｋｅｔｓｕ民ｅｔａｌＮａｔｕｒａｌｌｏｃｃｕｒｒｉｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎ江ｈｕｍａｎｃａｎ［巧Ｏ，，，ｙｇｎｅｕｔｒａｌｉｚｅａｂｒｏａｄｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｉ打ｆｌｕｅｎｚａｓｔｒａｉｎｓｉｎｃ山出打ｇＨ３，ＨＩ，Ｈ２ａｎｄＨ５口］？Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖ－ｉｒｏｌｏ２０１１：ＪＶＩ．０巧９７１１．ｇｙ，ｒａｕｓｅＪＣＴｓｉｂａｎｅＴＴｕｍｅＭｅｔａｌ．Ａｂｒｏａｄｌｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ巧別Ｋ，，ｐｙ了，ｙｇａｎｔｉｂｏｄｙｔｈａｔｒｅｃｏｎｉｚｅｓａｃｏｎｓｅｒｖｅｄ，ｎｏｖｅｌｅｉｔｏｅｏｎｔｈｅｌｏｂｕｌａｒｈｅａｄｏｆｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｚａＨｌＮｌｇｐｐｇ－ｖｉｒｕｓｈｅｍａｌｕｔｉ打Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ，２０１１，８５口０）：１０９０５１０９０８．ｇｇｇｙ吊‘［９０］ＨｏｎｇＭ，ＬｅｅＰＳ，Ｈｏｆｍａｎ民ＭＢ，ｅｔａｌ．ＡｎｔｉｂｏｄｙｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐａｎｄｅｍｉｃＨｌＮｌＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＫｃｅｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ２０１３８７２２：ｐｇｙ，，（）２４７－１１１２４８０，巧。ＺｈｕＸ，ＧｕｏＹＨ，ＫａｎｇＴ，ｅｔａｌＡｕｎｉｑｕｅａｎｄｃｏｎｓｅｒｖｅｄｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｅｉｔｏｐｅｉｎＨ５Ｎ１ｐｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｄｅ打ｔｉｆｉｅｄｂｙ孤ａｎｔ化ｏｄａａｉｎｓｔｔｈｅＡ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｄｏｎ／ｌ／９６ｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｙｇｇｇｇｇ［叮Ｊｏｕｒｎａ２０－ｌｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ，１３，８７（２３）：口６１９１２６３５．气Ｉｔｏｈ义Ｙｏｓｈｉｄａ民ＳｈｉｃｈｉｎｏｈｅＳｅｔａｌＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｉｃａｃｏｆａｓｓｉｖｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈ巧。，，ｙｐｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｏｆＨ５Ｎ１ｈｉｇｈｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉ凸ｆｅｃｔｉｏｎＪ．ＰＬｏＳａｔｈｏｅｎｓ２０１４１０６：ｅｌ００４１％．［］ｐｇ，，（）化姐ＬＩｄｅＨｔｌ－３ＣａｒｄｏｓｏＦＭｅｚ．ＳｉｌＡｔｉｂｉｔｉ，ＶａｎｎｏｅｃｋｅＳ，ｅａｎｅＤｏｍａｉｎｎｏｄｅｓＴａｉｅｎ巧］，ｇｇｇｕｒｎａ＇ＮｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅＰｒｏｔｅｃｔａａｉｎｓｔａｎＨ５Ｎ１ＩｎｆｌｕｅｎｚａＷｕｓＣｈａｌｌｅ打ｅ？Ｊｏｌｏｆｖｉｒｏｌｏ２０１４ｇｇ机ｇｙ，，－８８１５．：８２７８８２％（）Ｎ－口句Ｓｈｏｊｉ义ＣｈｉｃｈｅｓｔｅｒＪＡ，ＰａｌｍｅｒＧＡ，巧化Ａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａ１ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｓｐｅｃｉｆｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗｉｔｈｂｒｏａｄｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙａｇａｉｎｓｔＨ５Ｎ１ＨＰＡＩｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｈｕｍ－ａｎｖａｃｃｉｎｅｓ２０１１，７ｓｕｌ：１９９２０４．，（ｐ）９５ＤｏｙｌｅＴＭ，ＬｉＣ，ＢｕｃｈｅｒＤＪ，ｅｔａｌ．Ａｍｏｎｏｃｌｏ打ａｌａｎｔｉｂｏｄｙｔａｒｅｔｉｎａｈｉｇｈｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄ１；］ｇｇｙｅｐｉｔｏｐｅｉｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＢｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｐｒｏｖｉｄｅｓｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．－Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｂｉｏｈｓｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２０１３４４１１：２２６２巧．ｐｙ，，（）［９巧ＷａｎＨＧａｏＪ，ＸｕＫ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｆｏｒｂｒｏａｄ打ｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ２５ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定ｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎｓｅａｓｏｎａｌａｎｄａｎｄｅｍｉｃＨｌＮｌａｓｗｅｌｌａｓＨ５Ｎ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｐ［］－ｖｉｒｏｌｏ２０１３８７１６：％９０９３００．ｇｙ，，（）９７方钟文新王明桥，集高致病性禽流感病毒Ｈ５Ｎ１中和抗体的单链抗体构建与［］，罗生物工程学报２００７－活性整定Ｊ．，２３２：２９２２％．［］，（）．Ｈ５Ｎ１巧巧张晚曾晓燕，等型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的棘选及其中和机，巧替－制初步研究口］．ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｈｓｉｃｓ２０１１，３８６：５１９５２７．ｐｙ，（）巧－ｈａｎＺｈａｎｌ．Ｈ４ｌｉＦｔｉｂｉｉ巧句ＺＸ，ＱｉＸ，ａｕｍａｎＦ５ｓｉｎｅｃｈａｎｖ沾ｉｏｄｒｅｃｏｎｚｎ过ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｇ，ＱｇｇｙｇｇＨＡｌｅｉｔｏｅｈａｓｂｒｏａｄｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｏｔｅｎｃａａｉｎｓｔＨ５Ｎ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｐｇｐｙｇ－ｃｌａｄｅｓ［Ｊ］．Ａｎｔｉｖｉｒａｌｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，９９（２）：９１９９．－Ｘ－１００ｉｏｎＦ，ＸｉａｋＷａｎＪ，ｅｔａｌ．ＡＨｉｈＡｆｉｎｉｔＤＲＧｒａｆｔｅｄＡｎｔｉｂｏｄａａｉｎｓｔＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ［］ｇｇｇｙＣｙｇＨ５Ｎ１ＶｉｒｕｓｅｓＲｅｃｏｇｎｉｚｅｓ汪ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＥｐｉｔｏｐｅｏｆＨ５Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ…？ＰｌｏＳｏｎｅ，２０１４，９（２）：ｅ８８７７７．［１０１］ＷｕＲ，ＬｉＸ，ＬｅｕｎｇＨＣ，ｅｔａｌ．ＡｎｏｖｅｌｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｄｉｖｅｒｓｅｃｌａｄｅｓｏｆＨ５Ｎ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓａｎｄｉｔｓｍｕｔａｎｔｓｃａａｂｌｅｏｆａｉｒｂｏｒｎｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＪ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌｒｅｓｅａｒｃｈ２０１４１０６：ｐ［］，，１３－２３．Ｔｍｅｎ－１０２ＧｕｏＣａｎＹｉＺｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｔａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａａｎｅｌｏｆｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｅ［］，ｇ，Ｑ，ｐｐｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｅｎｅｒａｔｅｄｕｓｉｎＨｌＮｌｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＪ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏ２０１５．ｇｇ［］ｇｙ，１０３Ｇ山ＸＧｅＰＷａｎ．ＩｄｅｎｔＸ，ｅｔａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｈｉｈｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｓｕｒｆａｃｅｅｘｏｓｅｄ［］，，ｇｇｙｐ－ＢｃｅｌｌｅｉｔｏｅｏｎｔｈｅｎｕｃｌｅｏｒｏｔｅｉｎｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓ［Ｊ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｍｅｄｉｃａｌｖｉｒｏｌｏ２０１４ｐｐｐ］＾，，８６６－：９９５１００２．（）２６ 试验部分第二篇试验部分２７ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定摘要本实验利用杂交瘤细胞技术制备流感病毒的单克隆抗体，通过血凝抑制试验０Ｃ５、、初步筛选出了２、２０Ｈ７、５Ｆ７３Ｆ７、９Ｅ６、１９Ｃ９４Ｇ４、４Ｅ４、１０Ｂ６和２Ｆ７等１０株可能对流感病毒具有中和活性的单克隆抗体。随后通过微量中和试验和血凝抑制试验对这１０株单克隆抗体进行基本鉴定。将单克隆抗体纯化后，利用微量中和试验预实验检测这１０株单克隆抗体对甲型流感病毒的Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２亚型ｋ乂及乙型流感病毒的Ｙａｍａｇａｔａ系的中和活性。利用中和试验预先筛选出了４株４可能对中３中流感病毒同时具有中和活性的单克隆抗体。用这株单克隆抗体进行微量中和试验检测其对Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９和Ｈ９Ｎ２亚型的甲型流感病毒及乙型流感病毒的Ｙａｍａｇａｔａ系和Ｖｉｃｔｏｒｉａ系的中和活性。最后利用血凝抑制试验检测这４株单克隆抗体对这６种流感病毒的血凝抑制活性。关键字：杂交瘤细胞技术、单克隆抗体、微量中和试验、血凝抑制试验１Ｗ５年Ｋｏ纯ｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ首创了杂交瘤细胞技术，首次制备出了鼠源性单。克隆抗体，因此开启了由多克隆抗体向单克隆抗体转变的新时代单克隆抗体具有高度特异性，且效价与纯度均比多克隆抗体高，较少或甚至不发生血清交叉反一应，产性。随着科技的。同时单克隆抗体成本低易用于大量生产品具有高度均飞速发展，目前可用于生产单克隆抗体的技术除了杂交瘤细胞技术外，还有睡菌体展示技术，表。这些技术推动了单克隆抗体在、核糖体展示技术面重塑技术等疾病的治疗诊断。、基础研究Ｗ及临床实践中的发展在基础研究中，单克隆抗体根据性质的不同主要分为两类，分别为具有中和，活性单克隆抗体，即中和抗体称为血凝；Ｗ及具有血凝抑制活性的单克隆抗体抑制抗体，。这两种抗体在研究广谱疫苗病毒颗粒表面保守抗原Ｗ及抗体结合位点等基础研究中起着重要的作用。１材料与试剂１．１材料（１）Ｂａ化／Ｃ小鼠购自南京医科大学动物实验室。（２）ＭＤＣＫ细胞由江苏省疾病预防控制中也流感实验室提供。（３）Ｈ１Ｎ１；Ａ／Ｊｉａｎｇｓｕ／１／２００ＷＥ＾１Ｎ１）；Ｈ３Ｎ２：Ｂ／Ｎａｎｇｉｎ／ｓ１６２８／２００９ｊｇ２９ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制各及初步鉴定Ｈ５Ｎ１：Ｂ／Ｎａｎｇｉｎ／ｓｌ６２８Ｃ００９ｊｇＨ９Ｎ２；Ｂ／Ｎａｎｇｉｎ／ｓｌ６２８／２００９ｊｇ乙型Ｙａｍａｇａｔａ系；Ｂ／Ｎａｎｉｎ／ｓ１拍８／２００９ｊｇ己型Ｖｉｃｔｏｒｉａ系：Ｂ／Ｎａｎｊｉｎｇ／Ｖ／２００９Ｗ上流感病毒毒株由江苏省疾病预防控制中也流感实验室提供；（４）弗氏佐剂、不完全佐剂、牛血清白蛋白化ＳＡ）、ＨＡＴ（５化），购自Ｓｉｍａ。ｇ（５）ＤＭＥＭ培养液（含有以谷氨醜胺）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ、ＨＥＰＥＳ缓冲液、胎牛血－－－、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、０．２５％ＴｒｓｉｎＥＤＴＡ族酶、ＯｔｉＭＥＭ、ＴＰＣＫ膜酶清（ＦＢＳ）ｙｐｐ，购自Ｇｉｂｃｏ。（６）台盼蓝购自Ｎａｌｇｅｎｅ。（７）ＴＭＢＳｕｂｓｔｒａｔｅＫｉｔ购自Ｔｈｅｒｍｏ。－（８）Ｂｌｏｔｉｎ－ＧｒａｄｅＢｌｏｃｋｅｒ购自ＢｉｏＲＡＤ。ｇ（９）１抗：甲型和乙型流感病毒ＮＰ蛋白的单克隆抗化购自ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ。（１０）２抗：辣根酶标记的山羊抗小鼠Ｉｇ句构自北京中杉金娇。（１１）其他耗材由实验室提供。１．２试剂配制（１）－细胞培养液的配制：５００ｍＬＤＭＥＭ液中加入ＰｅｎＳｔｒｅｐ５ｍＬ，ＨＥＰＥＳｍＬ，７．５％牛血．５ｍＬｌ。缓冲液１２．５清白蛋白１２，５０ｍＦＢＳ（２）冻存液的配制：将胎牛血清与二甲基亚讽相混合，使二甲基亚讽的终浓度为１０％。（３）：５００ｍＬＤＭＥＭ培养液中加入ＰｅｎＳｔｒｅ５ｍＬ病毒维持液的配制向ｐ，－ＨＥＰＥＳ１２．５．５％１２．５ｍＬＴＰＣＫ．ｌ。缓冲液ｍＬ，７牛血清白蛋白，５ｍ膜酶０（４）０．８７５％生理盐水的配制；称取８．７５ｇＮａＣｌ，加入装有ＩＬ去离子水的广口瓶中，摇动广口瓶使其充分溶解。（５）１％紅细胞悬液的配制：将血液分装入两个１５ｍＬ离也管中，向管中加入ｍ离也一生理盐水至１４ｍＬ，上下晃动混匀后，９００ｒ１０ｍｉｎ。ｐ弃上清，重复前步２次一ｍｎ。５００５０ｍＬ，最后次１０００ｉｐ离也１０ｍｉ弃上清，吸取咕红细胞至离也管中，加生理盐水至５０ｍＬ，混匀即可。（６）ＨＴ培养液：５０ｍｌＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ＋ｌｘＨＣＳ＋１ｍｌ＋５０ｘＨＴ。－ＭＥＭ＋（７）克隆培养液的配制；Ｏｐｔｉ１５％ＦＢＳ＋ｌｘＨＣＳ。－－ＭＥＭ＋１０％Ｒ３Ｓ＋ｌ％Ｐ／Ｓ＋ｌ％Ｇ山＋（８）杂交瘤细胞培养液；Ｏｐｔｉ１％２Ｍｅ。（９）固定液的配制：吸取丙丽用ＰＢＳ稀释，使两爾终浓度为８０％。固定液需‘Ｃ要即配即用，并置于４保存。（１０）封闭液的配制：封闭液为５％牛奶。称取２．５ｂｌｏｃｋｅ雑于５０ｍＬＰＢＳ缓ｇ３０ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定冲液中。（１１）终止液的配制：终止液为１Ｎ硫酸，取２８ｍＬ浓硫酸加入１Ｌ去离子水中。２方法２．１单克隆抗体的制备２．１．１抗原制备２丄１．１细胞培养ＭＤＣＫ细胞后－（１）复苏，将细胞传２３代，毎天观察细胞状态，待细胞状态稳定后可进行后续试验。２一一（）如果复苏细胞的代数较低则在细胞传到定代数后需要冻存批细胞，Ｗ保存细胞。２．１丄２接种病毒１显微镜下观察细胞生长状态－（）在。ＭＤＣＫ细胞长至７５％９０％单层时，则可２接种病毒。若已知病毒的血凝滴度则可将病毒稀释至血凝滴度为２芳宜，若不知病毒的血凝滴度则用病毒维持液按１；１００的比例稀释病毒。（２）用ＨＢＳＳ溶液将细胞清洗３遍后，用移液枪吸取２０〇ｎＬ稀释过的病毒液加入细胞瓶中，轻轻晃动细胞瓶使病毒液与细胞充分接触。随后将细胞培养瓶置于’３７Ｃ，５％Ｃ〇２培养箱中吸附１ｈ。（３）吸出接种病毒液，然后向瓶内加入７ｍＬ病毒维持液。随后将培养瓶放入’３７Ｃ５％－Ｃ〇４５，２培养箱中培养天。每日观察细胞病变情况并记录。’－－（４）当７５％１００％的细胞出现相应的病变时可收获病毒。将细胳瓶放入７０Ｃ冰箱中－，反复冻融１２次，使细胞破裂，择放细胞内的病毒粒子。（５）收获病毒时，捏轻晃动细胞瓶数次，然后用移液枪吸取病毒液，加于１５ｍＬ。无茵离也管中，９００ｒｐｍ离也１０ｍｉｎ。（６）弃沉淀，将上清吸至新的１５ｍＬ无茵离也管中，混匀病毒收获的病毒液可立即进行血凝抑制试验。，Ｗ测定其滴度然后将病毒液进行分装标记，分装后‘病毒液置于－７０Ｃ冰箱冻存待用。２丄２动物免疫（１）首免。分别吸取Ｈ１、拟、拟和乙型流感病毒的活病毒抗原０．２５ｍｌ与等体积的弗氏佐剂充分混匀并乳化后免疫小鼠。毎种流感病毒分别免疫３只小鼠。ｍｌ－。每只小鼠后腿肌肉和皮下共注射０．５抗原佐剂海合液（２）二免。分别吸取Ｈ１、Ｈ３、Ｈ９和乙型流感病毒的活病毒抗原０．２５ｍｌ与等体积的弗氏佐剂充分混匀并乳化后免疫小鼠。３只小鼠每种流感病毒分别免疫。３１ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定０－每只小鼠后腿肌肉和皮下共注射．５ｍｌ抗原佐剂混合液。＝（３）免。直接用病毒培养液免疫小鼠。饲养１０天后采取眼眶血，用血凝抑制试验检测多克隆抗体的效价。２丄３血凝抑制法初步检测多克隆抗体的效价用血凝抑制试验检测血清抗体对其相对应的Ｈ１、Ｈ３、Ｈ９和乙型流感病毒的血凝抑制效价。２丄３１．质量控制（１）阳性抗体对照：阳性抗体为ＷＨＯ发行的阳性抗体。每孔加入２５叫＾病毒抗原＋２５曲阳性抗体＋５０咕１％红细胞悬液。（２）阴性抗体对照：阴性抗体为与流感病毒无关的大肠杆菌志贺毒素单克隆抗＋２５体。每孔加入２５＾１＾病毒抗原ｉＬ阴性抗体パ０＾＾Ｌｌ％红细胞悬液。＾＾■（３）病毒阳性对照：每孔加入２５２５ｌＬ生理盐水＋５０ａＬｌ％红细胞阵病毒抗原＾｜悬液。（４）阴性红细胞对照：每孔加入５０阵生理盐水＋５０曲１％红细胞悬液。２丄３．２血凝抑制试验（１）将小鼠眼球血离也取上清１０倍待用。，按照所需的量稀释（２）用排枪向９６孔￥型板第２列至第９列加入２５＾１１＾生理盐水（３）１０１＾用移液器分别将阴性抗体和阳性抗体加入第列和第１列，每孔加入２５叫抗体。（４）用移液器将第ｌ列每孔加入抗体原液２５ｉＬ，每种病毒做２个平行试验。＾（５）用移液器将第２列加入１０倍稀释后的与第１列相应的抗体，每孔加入５０阵１稀释过的抗体。（６）用排枪第２列各孔吸取２５＾Ｌ抗体至第３列，吹打混匀。依次由第２列至第８＾８２５列进行２倍倍比稀释抗体，最后第列弃去阵液体。使抗体稀释梯度为１１１２０１１２：０：：８０。，７１２２５（）血凝抑制试验板中除了第列，每孔加入曲的病毒抗原。°（８）轻疫弹击微量板，使抗原与抗体充分混合。置于巧０培养箱中艇育Ｉｈ。（９）用排枪向第１２列加入５０阵生理盐水，然后用排枪每孔加入５０叫１％红细胞悬液。轻弹血凝抑制试验板，使红细胞与海合物充分混合。置于室温解育３０ｍ－４ｉｎ５ｎｉｉｎ。观察实验结果并记录。（１０）结果判定。红细胞凝集抑制效价是指出现红细胞凝集抑制现象时血清的最高稀释度。流感病毒结果判定：待检血清对抗原的抑制效价大于等于４０才能认为该抗体有血凝抑制作用。３２ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定经检测，所有的血清抗体对其相应的病毒的血凝抑制效价都达到了６４０，则可进行细胞融合。２丄４细胞融合Ｂｔ－２０（１）用１０％ＰＳ的ＯｐｉＭＥＭ培养小鼠骨髓瘤细胞Ｓ／Ｐ。细胞融合前Ｓ天需对融合备用小鼠进行加强免疫。（）５０ｍＬ２０％ＦＢＳＯｔ－ＭＥＭＩ２融合时要准备ｉ，ｘＨＡＴ，ＩｘＨＣＳ，１％Ｐ／Ｓ，：１ｐ〇１２－２０１１／〇谷氨酸盐＾，０．％琉基乙醇，１１１３？溶液和５０％阳〇。实验前将这些试‘剂放入３７Ｃ恒温箱中预热。（３）取小鼠眼球血并储存。处死小鼠后将小鼠放入装有７０％酒精的烧巧中。（４刀和摄子，）用无菌的剪，切开小鼠腹部区域暴露腹膜，并切开腹膜并取出小鼠脾脏。将小鼠脾脏放置在无菌平皿中。（５）用７１０ｍＬＳＦ溶液，１０ｍＬ的注射器和２号针头向小鼠脾脏的不同位点注射充分冲洗，使脾细胞分散。随后将该溶液转移至１５ｍＬ离也管中。（６）用１ｍＬ注射器的背部轻轻研磨脾脏，用５ｍＬＳＦ溶液冲洗脾脏，随后将含有脾细胞的溶液加入之前的离也管中。（７）从培养瓶中将８／？２０细胞洗脱下来，充分混匀后取１０＾１１＾计算细胞浓度，７细胞浓度达到５ｘｌ０／ｍＬ为宜。将洗脱下来的Ｓ／Ｐ２０细胞移入离必管中。１２００ｒｐｍ离也５ｍｉｎ。用ＳＦ溶液洗涂细胞两次。（８）Ｈ１、Ｈ３、Ｈ９和乙型流感病毒免疫小鼠的脾细胞各取３．５ｍＬ加入洗过的８？、／２０细胞中，１３００巧１１１离也５１１１；１１。尽可能将８？溶液去除。离也后轻拍离屯管底部使两种细胞充分混匀。冻存余下的脾细胞。。（９）在１５１１１；１１１．５１１１１＾５０底？５〇直接慢慢地滴入混合细胞中。然后在．之内将８．５ｍｉｎ之内将２０ｍＬｌ预热的ＳＦ溶液逐渐加入混合细胞中。加入ＰＥＧ和ＳＦ时要轻轻摇晃使之与细胞充分接触。（１０）将混合细胞１０００ｒｐｍ离也５ｍｉｎ。１５ｍｎ。用１Ｌ预热的含有ＨＡＴ的选择培养（１）弃上清，将混合细胞静置ｉ５０ｍ液轻轻将细胞重悬浑。（１２）标记９６孔板１５（ｘＬ细胞混合液，将所有９６。％孔板中每孔加入Ｈ孔板放°入３７Ｃ５％Ｃ〇。４１００＾ＨＴ选择培养液２培养箱中进行培养天后每孔加入叫。２．１．５杂交瘤细胞的筛选用简略的血凝抑制法筛选阳性孔。（１）质量控制（详见２．２．２．Ｄ。（２）将抗２倍稀释９６孔Ｖ型板中加入２５＾生理盐水，体上清进行：先将叫然后从％孔培养板中吸取２５＾ｉＬ上清加入装有生理盐水的％孔Ｖ型板中，充３３ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定分混匀后弃去２５ｉＬ混合液。ｆ（３）６２５＾Ｖ型向９孔Ｖ型板中加入的相应的病毒抗原，轻拍板使病毒与°含有抗体的培养液充分混匀，置于３７Ｃ５％Ｃ０２培养箱中培养Ｉｈ。一（４）用排枪向新的９６孔Ｖ型板中的第行加入５０咕生理盐水，然后用排枪向装有生理盐水或者抗原抗体混合液的％孔Ｖ型板中加入１％红细胞悬液，每孔加入５０叫＾１％红细胞悬液。轻弹血凝抑制试验板，使红细胞与混合物充分３０ｎ－混合。置于室温脖育ｍｉ４５ｍｉｎ。观察实验结果并记录。（５）用克隆培养基将未出现血凝抑制的阳性孔中的细胞进行重悬浮。转入２４孔板中进行培养。（６）用上述血凝抑制法简略筛选出２４孔板中的阳性孔，用阳性孔中的杂交瘤细胞进行克隆。２丄６杂交瘤细胞的克隆（１）可提前２４小时准备培养小鼠腹腔细胞即饲养细胞。将９６孔细胞培养板．１ｍＬ的每孔加入０小鼠腹腔细胞，置于３７。５％０）培养箱中培养２４小时，２待用。‘（２）将克隆培养基置于３７Ｃ培养箱中预热２４孔板中阳性。用克隆培养基将孔的细胞进行重悬浮。取１０［１］：细胞悬液与１０扣＾台盼旌充分泡合后，用移液枪１分别吸取混合液加入样品板中，每槽０Ｌ。放入细胞计数仪中计数。根据计数Ｈ２００４０２０结果，用克隆培养基将上述细胞悬液分别稀释成／ｍＬ、／ｍＬ、／ｍＬ的细胞悬液。（３）用移液枪将细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞％孔板中，每孔０．０５ｍＬ，细胞含量分别为１０个化、２个化、１个化和０５．个化。一（４）用显微镜观察各孔中克隆细胞的数量，选择含有个克隆细胞的孔，弃掉含有两个或两个上克隆Ｗ及没有克隆细胞孔。‘－（５）将该９６孔板置于３７Ｃ，５％０）２培养箱中进行培养。培养７１０天，至／３－克隆细胞铺满１１／２的孔底时，收集上清液。用简略的血凝抑制法（详见２．２．４杂交瘤细胞的筛选）筛选出阳性孔。一一（６。－）将单个克隆细胞繁殖的阳性孔再次进行亚克隆般需要重复３５次，当阳性孔率达１００％时即可，如此可Ｗ稳定克隆细胞的遗传状态，并可确保单克隆抗体由单个稳定的克隆细胞所产生。（７）克隆后，将克隆细胞移至Ｔ７５细胞培养瓶中，并用常用杂交瘤细胞培，养液培养杂交瘤细胞并收集上清。对己制备完成的杂交瘤细胞传代扩増后，需要进行冻存，Ｗ供后续试验使用。３４ 抗流感病奉中巧性单克隆抗体的制备及初步鉴定２．２单克隆抗体的初步鉴定２．２．１微量中和试验检测单克隆抗体的中和活性２．２丄１抗体纯化－（１）杂交瘤细胞的培养：用２０％ＦＢＳＯｐｔｉＭＥＭ培养液在Ｔ７５细胞瓶中培养能一－上清产生待测抗体的细胞系。第次培养时加入１５ｍＬ，４５天后收集，并进行传代，３０ｍＬ。用细胞刮将杂交瘤细胞从瓶壁刮落然后用移液器加入培养液，吹打混匀１５－５。吸取１５ｍＬ杂交瘤细胞悬液分别加入新的７细胞瓶中。当传至６瓶时则可不传代只换培养液Ｗ收取上清。（２）抗体纯化：收集５００ｍＬ６００ｍＬ的抗体上清即可进行纯化。纯化时使用纯化仪器进行纯化。３一（）透析：将半透膜在沸水中煮ｌＯｍｉｎ，然后用两个夹子夹住半透膜的段口一开，将纯化的抗体注入半透膜中。随后用两个夹子夹住膜的另端开口。垂直，观察两端是否漏水提起装有纯化抗体的半透膜袋。如不漏水则将装有抗体的半一一透膜放入装有ＰＢＳ的烧林中进行透析。般透析两天，每天早中晚各换次ＰＢＳ。（４）收集单克隆抗体，１．５ｍＬＥＰ：透析完成后将抗体吸出分别装入管中，’－２０Ｃ冰箱中保每管装入ＩｍＬ。做好标记后放入存。２．２１１（１〇．．２病毒：５〇的；商定‘一ＭＤＣＫ细胞铺半块（１）准备细胞：病毒滴定前天用９６孔板，置于３７Ｃ５％Ｃ０２培养箱中培养２４ｈ。（２）病毒稀释：在ＥＰ管中，用病毒维持液采用对数稀释法稀释待测病毒，使稀－－－－１２３Ｗ……释度分别为１０，１〇１〇１０，。，祸旋混匀病毒液（＾ＨＢ３）接种病毒：先用排枪吸取１００叫ＳＳ溶液将细胞清洗两遍。随后将（２）中已稀释的病毒液，依次加入９６孔ＭＤＣＫ细胞板中，每个滴度做４个平行。每孔加入病毒液１〇〇１１。每块细胞板留最后两列（即１１、１２列）做ＭＤＣＩＣ细胞对照，［即送两列每孔只加入１００＾ｌｌ病毒维持液。将％孔细胞板置于３７＾５％０）２培养箱培养９６ｈ。（４），固定细胞：９６ｈ后取出该９６孔板用排枪尽量吸尽％孔板中的液体。换枪一头，用排枪吸取２００ｎＬＰＢＳ缓冲液加入９６孔板中，清洗细胞次。尽量吸出培养板中的ＰＢＳ，但不可使细胞干燥。弃枪头。随后用排枪从加样槽中吸取１０（ＶＬ固定液加入％孔培养板中，使各孔含有１００叫＾固定液。盖上９６孔细胞板板盖，防止固定液挥发。置于室温中１０ｍｉｎ后，弃去固定液，打开板盖。使９６孔板在室温中干燥。（５）ＥＬＩＳＡ法测ＴＣ阻５０；将固定好的９６孔培养板放置己设好程序的洗板机上用３５ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定ＰＢＳ洗３化将残留液体在吸水纸上尽量拍干，！＾去除残余的丙丽。按照１：５００的‘比例用封闭液稀释１抗，每孔加入稀释后的１抗１００ｉＬ，置于３７Ｃ中作用１ｈ。将［培养板放置洗板机上用ＰＢＳＴ洗４次，将残留液体在吸水纸上尽量拍干，Ｗ除去未结合的１抗：。按照１４０００的比例用封闭液稀释２抗（ＨＲＰ标记的山羊抗鼠ＩｇＧ），‘每孔加入１００叫释后的２抗，３７Ｃ作用Ｉｈ。将培养板放置洗板机上用ＰＢＳＴ洗６。次，将残留液体在吸水纸上尽量拍干，Ｗ除去未结合的２抗每孔加入ＴＭＢ显色底物１００ｉＬ。室温放置３１１１山左右显色。当病毒孔出现蓝色，１＾０（：反细胞对照ｔ１。未变色时，每孔加入００阵终止液终止反应随后用酶标仪（４５０ｎｍ）读出每孔ＯＤ值。（６）ＥＬ投Ａ结果判定：若ＯＤ值＞２倍ＭＤＣＫ细胞对照组的ＯＤ值即判定为阳性。（７）根据Ｒｅｅｄ和Ｍｕｅｎｃｈ方法计算出病毒的ＴＣ阻５０滴度。Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ方法计算ＴＣＩＤ比情况ｓｏ滴度的病毒稀释度配稀释度阳性数目阴性数目阳性数阴性数比率（５）阳性数百分ＩＩＩＩＩ（１）（２）（３）（４）出（６）－１１〇４０１１０１１／１１１００－２１〇４０７０７／７１００－３１〇３１３１３／４７５－＾１〇０４０５０／５０注１：汁算各病毒稀释度阳性孔数目（１）和阴性孔数目（２）注２：计算阳性和阴性孔的累积数阳性孔累计数由下向上累积（３）阴性孔累积由上向下累积（４）＝＋＝ｘ３；５３／３４：６５ｌ〇〇注：比率（）（）［（）（）］阳性孔的百分比（）（）注４：计算距离比＝－距离比例伏于５０％的阳性百分比－５〇ｙ５０％的阳性比小于５０％的阳性百分比（大于）＝＝７５－５０／７５－００（．３）（）＝ＴＣＩＤｓｏ的对数大于５０％的阳性百分比的最高稀释对数＋距离比例Ｘ稀释系数的对数＝Ｘ＝３＋０．３１３．３－３３ＴＣ瓜＝５〇／１００呼１〇－１３＝１００ＴＣ瓜５〇／１００咕１〇注５：稀释系数的对数１：１０稀释为１；半对数稀释为化５；倍比稀释为化３；１：５稀释为化７３６ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定２．２丄３质量控制（１）阳性抗体对照：阳性抗体为＼＾１＾０发行的阳性抗体。每孔加入５０＾１＾＾毒稀＋５释液０１１＾阳性抗体。［（２）阴性抗体对照：阴性抗体为与流感病毒无关的大肠杆菌志贺毒素单克隆抗体５（）ＬＬＬ。每化加入病毒稀释液パ０＾ｌ阴性抗体。＾（３）病毒阳性对照：每孔加入５０叫毒维持液巧０｜ｉＬ病毒（４）＾阴性细胞对照：每孔加入１００叫病毒维持液２．２丄４微量中和试验初步检测单克隆抗体的中和活性初步检测送１０株单克隆抗体对甲型流感病毒中Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２亚型及乙型流感病毒Ｙａｍａｇａｔａ系的是否具有潜在的中和活性。（１）ＭＤＣＫ细胞的准备：同２．２．１病毒ＴＣＩＤｓｏ的滴定的细胞准备步骤。一（２）待检抗体不进行稀释，株单克隆抗体对应每种病毒做３个平行试验。（３）稀释病毒：按照己计算出的各病毒的ｌＯＯＴＣＩＤｓｏ／ｌＯＯ叫的值，将各病毒稀释至ｌＯＯＴＣＩＤｓｏ／ＳＯ。阵（３）混合病毒和抗体：将（３）中配制好的病毒稀释液分别等体积地加入装有待测抗体、阳性抗体、阴性抗体和病毒维持液的ＥＰ管中。做好标记，锅旋混匀。°置于３７Ｃ，５％〔化培养箱中作用Ｉｈ。（４）用ＨＢＳＳ清洗细胞两遍后，将抗原抗体混合液加入％孔培养板中，没孔加入‘１００ｉＬ混合液。将该９６孔培养板置于３７（：，５％（：化培养箱賠育９６１１。＾（６）固定细胞与ＥＬＩＳＡ检测方法同２．２．１病毒ＴＣＩＤｓｏ的滴定中的细胞固定与￡０８八法测了（：１〇５〇。（７）结果判定：下列公式可用于判定中和试验结果Ｘ＝一（细胞半数感染域值）（细胞阳性对照平均ＯＤ值细胞阴性对照平均ＯＤ值）／２＋细胞阴性对照平均ＯＤ值当某孔的ＯＤ值低于Ｘ值时，则判定为中和试验反应阳性，中和试验反应为阳性的抗体最高稀释度即为血清的中和抗体滴度。２２丄５．微量中和试验通过微量中和试验检测单克隆抗体２０Ｈ７、１９Ｃ９、５巧和３Ｆ７对Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９和Ｈ９Ｎ２亚型的甲型流感病毒Ｗ及艺型流感病毒的Ｙａｍａｇａｔａ系和Ｖｉｃｔｏｒｉａ系的是否具有中和活性。（１）ＭＤＯＣ细胞的准备；同２．２．１病毒ＴＣＩＤｓｏ的滴定的细胞准备步骤。（２）待检血清的稀释：在ＥＰ管中，用病毒维持液采用对数稀释法稀释待测抗体，ｉ２３８＇一……混匀使之为ｉｃｒ，１（Ｔ，１（Ｔ１（Ｔ稀释度，祸旋。株单克隆抗体对应每种病３７ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定毒做３个平行试验。（）＾３稀释病毒：按照己计算出的各病毒的ｌＯＯＴＣＩＤｓｏ／ｌＯＯ叫的值，将各病毒稀释至ｌＯＯＴＣＩＤｓｏ／ＳＯ阵。（３）混合病毒和抗体：将（３）中配制好的病毒稀释液分别等体积地加入装有待’测抗体、阳性抗体、阴性抗体和病毒维持液的ＥＰ管中。祸旋混匀。置于３７Ｃ，５％ＣＸ）培养箱中作用１ｈ。２（４）洗细胞：使用排枪每孔加入１００叫＾ＨＢＳＳ溶液将细胞洗两遍。５－－（）加入病毒抗体混合物：９６孔细胞板中，１８列分别加入８个稀释度的待测抗，，１体，９列加入病毒阳性对照１０列加入抗体阴性对照１列加入抗体阳性对照，°１２列加入阴性细胞对照。每孔加入ｌＯＯｉＬ混合液。将该９６孔板置于３７Ｃ，５％Ｃ０２ｆ培养箱赔育９６ｈ。（６）ＥＬＩＳＡ检测方法２２ＩＤ固定细胞与同．．１病毒ＴＣｓｏ的滴定中的细胞固定与ＥＬＩＳＡ法测ＴＣＩＤ５ｏ。（７）结果判定．。：同２．２１．４中的判定方法２．．２２血凝抑制法检测单克隆抗体的血凝抑制活性利用血凝抑制试验检测单克隆抗体１９Ｃ９、２０Ｈ７和５Ｆ７对Ｈ１Ｎ１５Ｎ１、、Ｈ３Ｎ２、ＨＨ７Ｎ９和Ｈ９Ｎ２亚型的甲型流感病毒Ｗ及乙型流感病毒Ｙａｍａｇａｔａ系和Ｖｉｃｔｏｒｉａ系的是否具有血凝抑制活性。２．２．２．１根据血凝试验结果制备４个红细胞凝集单位的抗原。一个红细胞凝集单位是指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。进行ＨＡ一Ｉ试验时般采用４个红细胞凝集单位。计算出病毒稀释度。用病毒的ＨＡ滴度除Ｗ８，得到的商即为４个红细胞凝集单位的稀释度。２２２２．．．质量控制（１）阳性抗体对照：阳性抗体为ＷＨＯ发行的阳性抗体。每孔加入２５叫＾４个红细胞凝集单位的病毒抗原巧５＾阳性抗体巧０Ｌ１％红。叫＾ｉ细胞悬液（２）阴性抗体对照：阴性抗体为与流感病毒无关的大肠杆菌志贺毒素单克隆抗＋２５体。每孔加入２５阵４个红细胞凝集单位的病毒抗原阵阴性抗体＋５０阵１％红细胞悬液。（３）病毒阳性对照：每孔加入２５＾ｌＬ４个红细胞凝集单位的病毒抗原巧５ｌＬ生理＾％红细胞悬液盐水ＷＯ＾ｉＬ１。（４）阴性红细胞对照：每孔加入５０叫＾生理盐水＋５０＾１１＾１％红细胞悬液。２．２．２．３血凝抑制试验（１）将单克隆抗体按照所需的量稀释１０倍待用。（２）用排枪向９６孔Ｖ型微量板第２列至第９列加入２５阵生理盐水３８ 抗流感病辜中和巧中克降抗体的制备及初步鉴＆（３）用移液器分别将阴性抗体和阳性抗体加入第１０列和第１１列，每孔加入２５咕抗体。（４）用移液器将第１列每孔加入抗体原液２５＾１＾。（５）用移液器将第２列加入１０倍稀释后的与第１列相应的抗体，每孔加入５０ａＬ稀ｌ释过的抗体。（６）用排枪第２列各孔吸化２５＾ｌＬ抗体至第３列，吹打混匀。依次由第２列至第８列进行２倍倍比稀释抗体，最后第８列弃去２５冲液体。使抗体稀释梯度为１：１０１：２０１：１２８０。，（７）Ｖ型微量板中除了第１２列，每孔加入２５ｌＬ新配制的４个凝集单位的各种病＾毒抗原一２。株单克隆抗体对应每种病毒做个平行试验。（８）轻弹Ｖ型微量板，使每孔中的病毒抗原巧抗体充分混合。将Ｖ型微量板置于Ｉｈ培养巧中赠育。．（９）用排枪向第１２列加入５０ａＬ生理盐水，然后用排枪向每孔加入５０１％红细ｌ阵胞悬液。轻弹Ｖ型微量板，使红细胞与抗原抗体混合液充分混合。然后置于室温‘中脾育３０ｍｉｎ－４５ｍｎ。观察实验结果并记录。ｉ（１０）结果判定。红细胞凝集抑制效价是指出现红细胞凝集抑制现象时血清的最高稀释度的。流感病毒结果判定：待检血清对病毒抗原的抑制效价大于等于４０才被认为有血凝抑制作用。禽流感病毒结果判定：待检血清对病毒抗原的抑制效价大于等于８０才被认为有血凝抑制作用。Ｉ３实验结果１Ｎ（１）病毒培养。ＷＨ１亚型流感病毒为例，如下图所示：ｍｍ３９ 抗流感病毒中和性巧克降抗体的制备发初巧鉴＆；－亚型流感病專引起ＭＤＣＫ细胞病变１Ａｎｓｕｌ２００９Ｈｉｍ。（ａ）正常细胞。图１．接种／Ｊｉａｇ／／（）ＭＤＣＫ细胞。（ｂ）接种后发生病变的－ｓＦＩＧ１２００１Ｎ１ｎｆｌｕｅｎｚａｖｌｔｕｒｅｄｂＭＤＣＫｃｄｌｓ化ａｔ．１１Ａ／Ｊｉａｎｇｕ／／％Ｈ）ｉｉｒｕｓｃｕｙｃａｕｓｅｄｃｔｏａｔｈｅｃｔ．２Ｎ．Ｐｌ．ｙｐｉｃｅｆｆ（ｏｒｍａｌｃｅｌｌｓ（ｂ）ａ化ｏｏｉｃａｌｃｅｌｌｓ）ｇ（２）利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，并通过简略的血凝抑制试验初步筛选出了２０Ｃ５、２０Ｈ７、５Ｆ７、３Ｆ７、化６、１９Ｃ９、４Ｇ４、４Ｅ４、１０Ｂ６和２Ｆ７等１０株具有血凝抑制倾向，并可能具有中和活性单克隆抗体。（３）微量中和试验初步检测结果如下表所示：ａ（）°？〇＇＊１□ＸＯｘ］巧９Ｅ６巧２Ｆ７。＞目目ｎｎｒｔＡｎ同ｉ０１９０９：５巧Ｉ口ｐ；ｒａ：曰ａＯ＇ＪＮＭ口２０Ｃ５？□３Ｆ７口口口Ｑ２０Ｈ７８０１０６６ｎｎ□ｎ？口０２Ｄ４Ｇ４ｎｎ口化４ｎｎ〇ｎｎ〇ｊ圓ｒｉｌｌ圆ＩＩＩｊＷｔｔｅＭＷ－单由降抗体单克降抗体－０．８１—圆ＸＨｉ巧朋化对照－０．６曰阴件柿树照Ｉ■；Ｉ）：：３口］忡別照婪；口化＊口阳＇ｔＨ谢对照ｇｉｉｉ口非口ｉ賣ｉ；＝；－０．２ｇ賣５ｇ妄？＝ＩＰｕｙｒｎｎｎｎＴｉｎｏＪＪ中．克險抗化ｂ（）０．８１＿４．１－〇０曰Ｘｎｘ囚２Ｆ７囚５Ｆ７－０．８ｎｎ。０．６ｍｎ目。ｆｌｒｉ．３Ｆ７ｎｎ＿Ｉｎｎ口□化４２０Ｈ７０．□．６４Ｇ４霎口口口〇＊口巧。９口化６§ｎ因巧目Ｆｉｎｎｎｇ巧ｆ］０．４＝：２０５１０Ｂ６ｉＣ言口：Ｉ口口固目ｉｎ＇．０．２．＾０．２Ｊ１ｉＩｈｌｌ－１１１Ｉ１１１１１１１１１１１．｜，｜，｜｜｜｜１１，１１Ｉ１〇〇問Ｗ哪即川川〇．〇川ｇ哪即，北川化单克隆抗体单克隆抗体４０ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定。‘？０Ｘ］ｒａ巧讲悚对熙化？■＾曰間神誦特壬照円ｃａ雜幸对Ｉ墳Ｉ這Ｈ口—化４？８Ｓ１口ｍ巧；棚柏守照享Ｉ冈Ｊｊ．Ｕ．，．；ｎｍ加口单克巧抗体似。１－◎父口Ｘ气囚化４＾Ｅ３２０Ｃ５°３Ｆ７。，圆同目胃ｉ目：Ｓ７。．＊誌ｍｇ｜吕：ｉ某｜口９Ｅ６口１９Ｃ９。－＆－ｉｎＩＩ日ＩＩ删ｆ圆ｌｆ叩日？ＪＩ麵〇邮咖。。：ｊｎ。。。。叩尊克隆抗体单克隆抗体Ｉ．Ｓｉ—回ＸＰＩｍｎｎ巧ｗ件对照口阴性ｓａｗ照．Ｉｇ１？０园ｓＩＨ＾口阴化对陋ｇｓＩＮ口阳性抑树照＾胃＾：〇５圓！；＾ｉＨ；ｉＦｉｎｎｆｉｎｎ。．。ｊｊｊ单克隆抗体－２Ｘ值表示该抗体对该病毒无中和活化低于Ｘ值表图１．微量中和试验初步检测结果。高于示该抗体对该病毒据有中和活性（ａ）１０株单克隆抗体对Ｈ１Ｎ１亚型流感病毒中和活性的化ＩＳＡＸ＝０．３３２化）１０Ｂ型Ｙａｍａａ检测结果。株单克隆抗体对ｇｔａ系流感病毒中和活性的＝ＥＬＩＳＡ检测结果。Ｘ０．巧７（Ｃ）１０株单克隆抗体对Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒中和活性的ＥＬＩＳＡ二检测结果。Ｘ化６４８Ｆ－２ｒＩＧ１Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｅｌｉｍｉｎａｒｍｉｃｒｏｎｅｕｔａｌｉｚａｔｉｏｎｅｘｅｒｉｍｅｎｔ．ＡｂｏｖｅＸｖａｌｕｅｉｎｄｉｃａｔｅｄ化ｅｓｅｐｙｐ’ｔ化ｔｔｔｔ．ａｎｏｄｉｅｓｄｉｄｎｔｈａｖｅｍｉｃｒｏ打ｅｕｒａｌｉｚａｉｏ打ａｃｉｖｉｙｔｏｔｈｅｉ打打ｕｅｎｚａｖｉｍｓＢｅｌｏｗｔｈｅＸｖａｌｕｅｉｎｄｉｅ注ｔｅｄｔｈｅｓｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｈａｄｍｉｃｒｏ打ｅｕｔｒａｌｉｚ泣ｔｉｏ打ａｃｔｉｖｉｔｙｔｏｔｈｅｉ打ｆｌｕｅ打之ａｖｉｒｕｓ（）ｆｗＩｎｆｌｕ二．３３２ａ巨ＬＩＳＡｏ１０ｓｔｒａｉｎｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔＵｘ）ｄｉｅｓｉ化ＨＩＮｉｅｎｚａｖｉｒｕｓ．Ｘ０（ｂ）ＥＬＩＳＡ二ｗＢＹ．．５７ｏｆ１０ｓｔｒａｉｎｓｍｏ打ｏｃｌｏｎａｌａｎｔ化ｏｄｉｅｓｉ化ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｍｓａｍａｇａｔａＨｎｅａｇｅＸ０３（ａ）ＥＬＩＳＡ＝２ｖＸ．ｏｆ１０ｓｔｒａｉｎｓｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔ化ｏｄｉｅｓｗｉ化Ｈ３Ｎｉ打ｆｌｕｅｎｚａｉｍｓ．０６４８４１ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及巧步鉴定表＾１微量中和试验初步检測结果流感单克隆抗体病毒毒株２０Ｈ７１９Ｃ９２０Ｃ５１０Ｂ６２Ｆ７３Ｆ７４Ｇ４４Ｅ４９Ｅ６５Ｆ７Ｈ牛＋－－－＋＋１Ｎ１Ｈ３Ｎ２＋＋＋＋＋＋＋－＋＋Ｂ／Ｙａｍａａ－－－－ｇｔａ（４）微量中和试验结果如下表所示：表－２１微量中和试验结果单克隆流感病毒毒株抗体Ｈ１Ｎ１Ｈ３Ｎ２Ｈ５Ｎ１Ｈ７Ｎ９Ｈ９Ｎ２Ｂ／ＹａｍａｇａｔａＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ－－－１９Ｃ９１：１００－－２０Ｈ７－１：１０－５Ｆ－－７１：１０３Ｆ７－１０００：１（５）血凝抑制实验结果如下表所示：表＾３血凝抑制试验结果单克隆流感病毒毒株抗体Ｈ１Ｎ１Ｈ３Ｎ２Ｈ５Ｎ１Ｈ９Ｎ２Ｂ／ＹａｍａｇａｔａＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ１９Ｃ９ＨＩ效价＜１０扭效价＜１０曲效价＜１０曲效价＜１０曲效价＜１０曲效价＜１０２０Ｈ７ＨＩ效价＜１０曲效价＜１０曲效价＜１０出效价＜１０ＨＩ效价＜１０曲效价＜１０５Ｆ７曲效价＜１０曲效价＜１０曲效价＜１０曲效价＜１０证效价＜１０曲效价＜１０４试验结论通过首次微量中和试验初步筛选出了４株可能同时对Ｈ１Ｎ１和Ｈ３Ｎ２亚型的流感病毒同时具有中和活性的单克隆抗体。这４株单克隆抗体为２０Ｈ７、１９巧、５巧和３巧。随后的微量中和试验结果显示，单克隆抗体１９Ｃ９、２０Ｈ７和５Ｆ７对Ｈ３Ｎ２亚、型的流感病毒具有不同程度的中和活性，而对Ｈ１Ｎ１Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９和Ｈ９Ｎ２亚型Ｗ及乙型流感病毒均不具有中和活性。单克隆抗体３Ｆ７对Ｈ７Ｎ９亚型的流感病４２ 抗流感病奉中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定毒具有较强的中和活性。血凝抑制试验结果湿示单克隆抗体１９Ｃ９、２０Ｈ７和５Ｆ７对Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１和Ｈ９Ｎ２亚型的甲型流感病毒Ｗ及乙型流感病毒的Ｙａｍａｇａｔａ系和Ｗｃｔｏｒｉａ系的均不具有血凝抑制活性。＇寺？－Ｉ４３ 讨论与总结讨论与总结文章对近年来国内外的流感病毒广谱单克隆抗体的研究进展进行了综述。。５分别对针对ＨＡ头部和颈部的广谱单抗进行了较为详细的介绍如抗体ＣＨ６、－Ｓ１３９／１、Ｃ０５和Ｄ１８等都是结合ＨＡ头部的单克隆抗体，抗体Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０ＲＲ９１１４和Ｆ１ＨＡ茎部的单克隆抗体。对针对、Ｃ８０２０、Ｃ０等是可Ｗ结合到ＮＡ、ＮＰ、己型流感病毒Ｗ及近几年国内的流感单克隆抗体进行了简述。根据Ｈ－ＨＡ抗体的作用范围，包括１和Ｈ３亚型的广谱抗体ＣＨ６５和Ｄ１８，组１流感Ｒ病毒的广谱抗体Ｃ１７９、ＣＲ６２６１和Ｆ１０，ＨＡ组２流感病毒的广谱抗体Ｃ８０２０。ＨＡ組１和ＨＡ组２的通用广谱抗体ＣＲ９Ｈ４与Ｆ１６及ＦＩ３７０。同时还有，抗体Ｓ１３９／１和Ｃ０５可中和部分ＨＡ组１和ＨＡ组２的病毒，Ｗ及针对乙型流感病毒的广谱抗体ＣＲ８０７１和ＣＲ８０３３。另外，还有针对Ｈ５Ｎ１亚型流感病毒的广谱中和抗体１〇巧、８Ｇ１０Ｄ７、４Ｆ５、ｈＨ５Ｍ９和ＨＡｂ２１等。２－，在试验中，细胞复苏后需要连续传３代Ｗ稳定细胞状态否则在细胞处于刚复苏比较脆弱且不稳定的状态下进行试验，其结果对后续试验存在较大的影响。接种病毒时，需要将病毒稀释，高滴度的病毒液接种后滴度不会上升反而会下降，送是由于高滴度病毒液中病毒含量较高，可大面积吸附细胞，引起细胞大批量死亡且死亡速度较快，不利于病毒后期的增殖，同时也容易产生大量病毒缺一损颗粒，在细胞融合前３天要进行，激。在制备单克隆抗体过程中次加强免疫活已成为记忆细胞的Ｂ细胞，使之成为能分泌抗体的浆细胞，如不进行加强免疫则融合后很难筛选出能产生抗体的杂交瘤细胞。在整个试验中都需要用到ＭＤＣＫ。细胞，保证ＭＤＣＫ细胞的质量是确保整个试验能顺利进行的大前提得到新的ＭＤＣＫ细胞时，应首先检测该细胞对流感病毒的敏感性，如较为敏感则ＭＤＣＫ细一将其传代后冻存。胞复苏后般传至１０代左右，其对流感病毒的敏感，如不合格则应立即性会有所下降，送时应对该细胞的流感病毒敏感性进行检查一一更换细胞批次试验时则应使用同，。进行同批次的病毒和细胞保证试验的一致性。本试验通过小鼠杂交瘤细胞技术制备了２０Ｃ５、２０Ｈ７、５Ｆ７、３Ｆ７、９Ｅ６、１９Ｃ９、４Ｇ４、４Ｅ４、１０Ｂ６和２Ｆ７等１０株流感单克隆抗体。通过微量中和试验和血凝抑１制试验对这１０株单克隆抗体进行了初步鉴定。结果显示，单克隆抗体９Ｃ９、２０Ｈ７和５Ｆ７对Ｈ３Ｎ２亚型的流感病毒具有不同程度的中和活性但不具有血凝抑制活性。而单克隆体３巧对Ｈ７Ｎ９亚型的流感病毒具有较强的中和活性。＇７—＾＇１这１０株单克隆抗体与单克隆抗体Ｓ１３９／１和（：１７沪样，都属于鼠源单４５ 抗流感病毒中和性单克隆抗体的制备及初步鉴定克隆抗体１３９ｎ能中和Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ１３Ｈ１６等亚型的病。不同的是抗体Ｓ和毒，抗体Ｃ１７９是ＨＡ组１的广谱中和抗体，而单克隆抗体２０Ｈ７、５巧和１９Ｃ９目前只显示对Ｈ３Ｎ２亚型的流感病毒具有不同程度的中和作用。在后续试验中可检测这３株单克隆抗体是否对Ｈ３Ｎ２亚型中多株不同的毒株具有中和活性，即检ｓ－Ｗｔ测这３株抗体是否为Ｈ３Ｎ２亚型内的广谱中和抗体－，如同广谱单克隆抗体Ｄｌ８ｆｕ］—５－２和Ｆ００１２６样，该株抗体均为Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒的广谱中和抗体。虽然单克隆抗体２０Ｈ７、５巧和１９Ｃ９对Ｈ３Ｎ２亚型的毒株具有中和活性，但却不具有血凝抑制活性一一。某抗体对某毒株具有中和作用却不定会具有血凝抑３Ｐ，制活性，与抗体结合表位所在的位置有关。单克隆抗体Ｓ１３９／ｉ哨ｇ中和Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ１３等亚型的病毒，同时也能对送些病毒产生血凝抑制作用，这是由Ｐ，３］于抗体Ｓ１３９／ｉ与病毒颗粒ＨＡ上的唾液酸受体结合位点相结合，从而直接与Ｐ’３１１ｉ内源唾液酸受体相竞争，导致Ｓ３９／对这些亚型的病毒既具有中和活性，也能产生血凝抑制作用。但也有能结合ＨＡ头部区域但不具有血凝抑制作用的单克２ｔｉＦ００５－１２６１２３隆抗体，如单克隆抗体喘中和所有株ＨＮ２毒株但是却没有检测ｉ２ｔ］Ｆ００５－１２６Ａ到它的血凝抑制活性。抗体与Ｈ球状头部区域相结合，但不与头部区域的受体结合位点相结合。通常与ＨＡ茎部结合的中和抗体都是具有中和活Ｗ－７ｎ－Ｗ１ｔ１７民６２６１等性而不具有血凝抑制活性的抗体，如单克隆抗体Ｃ９和Ｃ。因此说明能与受体结合位点结合的抗体既具有血凝抑制活性同时也具有中和活性，而与ＨＡ其他抗原位点相结合的中和抗体，通常只具有中和活性而不具有血凝抑制活性。１在后续试验中，可针对单克隆抗体９Ｃ９的广谱性及其识别表位进行研究，因为单克隆抗体１９Ｃ９对Ｈ３Ｎ２亚型的流感病毒显示出了较强的中和活性。用微量中和试验检测单抗１９Ｃ９对多株不同的Ｈ３Ｎ２亚型的流感病毒株的中和活性，若该抗体对大多数毒株均有明显的中和活性，则认为该抗体为Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒的广谱中和抗体。随后可通过抗体逃逸株试验Ｗ及抗原抗体复合物晶体结构检测该抗体所识别的表位，再将该表位与其他表位进行对比，观察该表位是否为新的保守表位。这对后续广谱疫苗的研究与开发具有重要的意义。本试验在筛选单克隆抗体时，将抗体上清稀释两倍进行血凝抑制试验，从而筛选出具有血凝抑制倾向的单克隆抗体，但因此可能会筛漏部分完全不具有血凝抑制活性却具有中和活性的单克隆抗体。此为本试验中的在的不足之处，在Ｗ后的试验中需改进。４６ 参考文献参考文献．１中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中古标准操作规程ｓｏ．］，（巧川［－２ＹｏＲＩａｒａｉＭ０之ａｋｉＨｅａ．Ｃｒｏｓｃｖｅｏ化ｎｔａｌｏｆａｎｌ［ｓｈｉｄａｓｈｔｌｓｒｏ化ｔｉｉｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，ｇ，，ｐｏｖｅ］ｐａｎｔＡｏｄｙｄｉｒｅｃｔｅｄａｇａｉｎｓｔａｎｔｉｇｅｎｉｃｓｉｔｅ良ｏｆｔｈｅｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓＪ．ＰＬｏＳｇｇ［］ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，２００９，５（３）：ｅｌ０００３５０．３ＬｅｅＰＳＹｏｓｈａＥｅｅａ．ｒｏｓｃａｎｄｂｏｄｔｉｄＲｋｉｒｔＤＣｔｌＨｅｔｅｕｂｔｉｒｅｃｏｎｉｉｏｎｏｆＡｅｉｎｆｌｕｅｎｚａ［］，，，ｙｐｙ呂ｖｒｕｓｒｅｃｅｒｔＪ．ＰｒｉｎｔＮａｔｌｉｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｐｔｏｂｉｎｄｉｎｇｓｉｅｅｎｈａｎｃｅｄｂｙａｖｉｄｉｔｙｏｃｅｅｄｓｏｆｈｅｉｏｎａ［］ｇ－ＡｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ２０１１７１２０９４２：１７０４００４５．ｙ，，（）４］ＯｋｕｎｏＹ，ＩｓｅａｗａＹ，ＳａｓａｏＦ，ｅｔａｌ．Ａｃｏｍｍｏｎｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｅｐｉｔｏｐｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ［ｇｈｅｍａｕｎｎｎｚａＡｖｒｓＨＩａｎＨ２ｒ．Ｊｏｆｖｒｏｏｌｔｉｉｓｏｆｉｎｆｌｕｅｉｕｄｓｔａｉｎｓｕｒｎａｌｏｉｌ１９９３６７５：ｇｇＵ，，］ｇｙ（）２５５２－２５５８．５ＳｍＬ．ｉｍｏｖＩＵＡｉａｏｖＡＳＯｋＩｔａｌＡｃｏｍｍａｎｔｉｅｎｉｃｅＵｏｉｎｉｎ円ｕＡｖｉｒｕ，ｔ，ｕｎｏｅｏｎｅｅｎｚａｓ［］ｐ，［ｇｐｐ－Ｈ．Ｖ１Ｈｌ１．ＩＨ２Ｈ５Ｈ６ｈｅｍａｌｕｔｉｎｉｎＪｏｒｏｓｖｉｍｓｏｌｏｉｉ９９４４３：１５（，，，，乂（）ｇｇ］［］ｐｙｇ；）６ＳｍＹＡＬＡｅＡＫｅａ．ＡｎｅｓｈａｒｅｄｔｈｌｓｉｍｏｖｉａｔｏｖＳＧｉｔｌｍａｎｔｌｅｉｔｏｂｅｈｅｍａｕｔｉｎｉｎｏｆＨＩ［］，ｐ，，ｐｐｙｇｇ，－Ｈ２Ｈ５ａｎｄＨ６ｕｂｔｅｓｏｆＪ．ＡｌｓｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓ；ｉｒｉｃａ１９９９４３４：２３２４４．［］ｃｔａｖｏｏｇ，７，，ｙｐ，（）７ＤｒｅｆｕｓＣＥｋｉｅｒｔＤＣＷｉｌｓｏｎＩＡ．ＳｔｒｕｃＵｉｒｅｏｆａｃｌａｓｓｉｃａｌｂｒｏａｄｌｎｅ山ｎｌｉｚｉｎｅｍａｎｔｉｂｏｄ［］ｙ，，ｙｇ訂ｙｎｃｏｍｅｘｗｉａａｎｄｅｍｃＨ２ｅｎｚａｖｒｕｓｕｎｎＪ．Ｊｒｎａｌ２０１３ｉｌｉｄｐｉｉｎｆｌｕｉｈｅｍａｌｔｉｉｏｕｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙｐｇｇ，，［］８７１２－：７４９７１５４．（）１ＷＭ－ＪＳｍＫＪ巧ａ？民ｈ８ｒａｍｍｅｒｔｉ化ｉｌｌｅｒｌａｉｄｌｉｎｏｆｈｉａｆｉｎｉｔｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａ［］，，，ｐｃｏｎｇｇｙｌ－ａｎｔｉｂｏｄｓａｎｓｎｆｌｕｅｎｚａｖｒｕｓＪＮａｕｒｅ２００８４５３７１９５：７１．ｉｅａｉｔｉｉ．ｔ６６６７ｇ，，（［］）［９］ＢｅｎｊａｍｉｎＥ，ＷａｎｇＷ，ＭｃＡｕｌｉｆｆｅＪＭ，ｅｔａｌ．ＡｂｒｏａｄｌｙｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｏｄｒｅｃａａｎｓａｎｏｖｅｌｃｏｎｓｅｒｖｅｄｅｉｔｅｏｎｅｎｕｅｎｚａｖｒｕｓＨｉｔ化ｄｉ化ｄｉｔｏｔｈｉｆｌｉ３ｈｅｍａｌｕｎｉｎｙｇｐｐｇｇｔｏｂｕ－ｌａｅａｄＪ．Ｊｒｎａｏｆｖｉｒｏｏ２０１４８８１２：６７４３６７５０．ｇｌｒｈｏｕｌｌｙ［］ｇ，，（）ｌＯＮｒｈａＮＰｅａ－ｍａｋａｍｕａＧＣ．Ａｎｉｎｖｖｏｈｕｍａｎｌａｓｍａｓｅｎｒｕｅ［ｉａｒｋＳｔｌｉｂｌａｔｉｃｈｅｎｔｔｅｃｈｎｉ，，，Ｊｐｑａｌｌｏｗｓｒａｐｉｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ化ｅｒａｐｅ山ｉｃｉｎｆｌｕｅｎｚａＡａｎｔ化ｏｄｉｅｓＵ］．Ｃｅｌｌｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ，２０１３，Ｍ－ｌ１（）；９３０３．１１ＫｓＭＨ－ｏｕｄｔａａｌＷＫｏＢｒａｆｆＪＰＪＰｒｅａｎｄ１１ｓｅ［ｌｄｉｋｋｅｎｈｏｅｔａｌ．〇５｛６义〇５化ｕｏｆｈｕｍａｎ，，，］ｊ口口ｍｏｎｏｉＨ５Ｎ１１ｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｎｓｔａｎｄＨＩＮｉｎｆｌｕｅ打ｚａｖｉｒｕｓｉ打ｍｉｃｅ：ｖｉａｂｌｅａｈｅｍａｔｉｖｅ化ｓｅｖｒＪＪｏｕｒｎａＩｃｏｕｓＤｅｓ２００９２００１２－ｏ：１８７０１．ｌｔａｍｉｉ．ｌｏｆｎｆｅｔｉｉｓｅａｓ８７３，，［］（）２ｂａｕｉｉ］ｕｒｌｉｉ１Ｉ乂ＦｊＹ，ＯｈｓｈｉｍａＮ，ｅｔａ．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｎｅｔａｚｎｅｉ化ｅａｔｌｏｂｕｌａｒｈｅａｄｏｆ［］ｇｐｐｇ－ｈｅｍａｉＨ３ＮＪ２０ｌｕｔｉｎｎｉｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓＪ．ｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ１４８８１３７１３７１４４．，：０ｇｇ［］ｇｙ，（）１３ＴｈｒｏｓｂＭｖａｎｄｅ打ＢｒｉｎｋＥＪｏｎｅｎｅｅｌｅｎＭｅｔａｌ．Ｈｅ化ｒｏｓｕｂｔｉｃｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，，，［］ｙｇｙｐｇ＊ｒ－ｖｅａＨ５Ｎ１ａｎｌＮｌｒＭ＋ａｎｉｒｏｍｒＢｔ化ｏｄｉｅｓｃｏｓｓｐｒｏ化ｃｔｉｇａｉｎｓｔｄＨｅｃｏｖｅｅｄｆｈｕｍａｎＩｇｍｅｍｏｙｃｅｓＪＳｏｎｅ２００８３１２３９４２．ｌｌ．Ｐｌｏ：ｅ，，（）［］［１４巧ｋｉｅｒｔＤＣ，目ｈａｂｈａＧＥｌｓｌｉｇｅｒＭＡ，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄ－ｎｆｌｕ州ｚａｖｍｅＪ．ｅｎｃｅ３２４：２４２５１．ｉｉｓｉｔｏＳｃｉ２００９９２４６巧ｐ，，口［］）１５ｗａｎｆｕ－ＳｕＷＣｉｒｉＪＨＰｅｒｅｚＳｅｔａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｎｃｔｏｎａｌｂａｓｅｓｆｂｒｂｒｏａｄｓｅｃｔｕｍ，，，［］ｇｐｎｅｕｒｉｉｈｕｍｉｎｆｌｕｅｎｚＡｖｉｅｓＪ．Ｎｔｒｕｃｕｒａｌ＆ｍｏｃｕｂｉｔａｌｉｚａｔｏｎｏｆａｖａｎａｎｄａｎａｍｓ］ａｕｒｅｓｔｔｌｅｌａｒｏｌｏ，［ｇｙ２００９１－６３：２６５２７３．，（）１６ＥｋＣＦｒｎ民ＨＥＢｅ．ＡＣＯ打ｓｅｒｖｅｄ打ｅｕｒａｚｎｅｒｉｅｒｔＤｉｅｓｅｈａｂｈａｔａｌｈｉｈｌｙｔｌｉｉｅｏｎｏｕ，，ＱｇｐＨｏｐ［］ｇｇｐ２２０－ｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｍｓｅｓＪＳｃｉｅｎ１１３扣６０４４４３８５０．．ｃｅ，：８，（）［］４７ ＾致谢本论文是在导师姚火春教授和祁贤副研究员的精也指导下完成的。值此论文！付梓么际，谨向尊师致Ｗ崇离的敬意和衷也的感谢试验大部分是在江苏省疾病预防控制中也流感实验室中完成，同时还得到了病原微生物研究所焦永军副所长，曾晓燕老师，张黎老师，史凤娟老师的大力帮一！助，在此并致Ｗ崇高的谢意学习期间，得到了实验室资海荣、章倩云、郭艳、刘丹丹、宋路等给予的支！持和帮助，在此表示深深的谢意再次感谢给位老师及同学给予的支持、关也、理解和帮助！，感谢父母和家人对我的关爱及对我学业的大力支持和鼓励４９
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