金属离子对纤维酶活性的影响

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1、齐齐哈尔大学课程实验论文课程实验论文学院：食品与生物工程学院专业：生物工程班级：082班姓名：赵性林学号：20080530575齐齐哈尔大学课程实验论文金属离子对纤维酶活性的影响摘要：研究了多种金属离子对放线菌纤溶酶活性的影响。通过研究金属离子对纤溶酶活性的影响，探讨金属离子对纤溶酶活性影响的作用机理。关键词：金属离子纤溶酶活性1前言1.1纤溶酶概述纤溶酶可来源于人体、动物和微生物等。其中以微生物产酶的来源最广泛。除早期发现的溶血链球菌产链激酶和金黄色葡萄球产葡激酶外,又陆续发现一些菌株产纤溶活性物质。主要

2、有来自芽孢杆菌的纤溶酶、来自芽孢杆菌的纤溶酶及其它微生物来源的纤溶酶。随着生物技术不断发展,近年来又有学者陆续从海洋假单胞杆菌、根霉中筛选到了新型的具有纤溶活性的物质,并对其中的某些活性成分进行了分离提纯,对性质、药理和药效进行了研究。我国的刘晨光等[13]从一株洋溢假单胸杆菌中分离纯化出一种具有纤溶活性的酶,分子量为21kDa,等电点为7.4～7.5,最适温度为50℃。该酶能够切割Arg或Lys形成的肽键。但是对该酶结构、催化特征以及毒理、药效作用等研究还未见报道。在国内现有的相关研究主要集中在纤溶酶产生

3、菌种的筛选、发酵条件的优化等方面。对于豆豉纤溶酶的分离纯化及酶学性质的研究非常有限，对其核苷酸和氨基酸分子水平的研究更为鲜见。目前我国研究人员从豆豉中分离得到了一种高活性的纤溶蛋白酶，它有较强的溶血栓能力、不溶解正常血细胞、无毒副作用以及在体内的半衰期较长等特性。其次由于该酶具有分子量小可通过消化道直接吸收由此可开发为口服药;再则该酶可通过大量发酵生产造价低的优点因此在心脑血管疾病的防治上有着良好的应用前景。国外的研究领域在研究中发现：纤溶酶能将纤维蛋白（原）α-链和β-链P1位点的疏水性氨基酸进行特异性的

4、酶切，从而产生与体内纤溶酶相似的酶切片段，其次纤溶酶还能通过酶切纤溶酶原激活抑制剂及使之处于无活性状态等作用进行血栓溶解。1.2本文的主要研究目的本文是对金属离子对纤溶酶活性进行研究。为了解纤溶酶的性质为临床提供一些理论依据。2实验方法及材料2.1主要试剂仪器5齐齐哈尔大学课程实验论文放线菌纤溶酶、各种盐试剂ZnSO4·7H2OCuSO4·5H2ONaClKClCaCl2CoCl2·6H2OMgSO4·7H2OMnCl2·4H2OFeCl2·4H2O血纤维蛋白平板、离心管、小烧杯、容量瓶、双蒸水等。2.2实

5、验方法与步骤分别配置各种离子溶液1ul/mol、2ul/mol、5ul/mol、10ul/mol、100ul/mol，取放线菌纤溶酶20ul和各种离子溶液及不同浓度溶液20ul混合至离心管中，等体积混合。另配置水和纤溶酶的对照用液。全部置于37°C恒温18个小时候后取出，各取10ul滴血纤维蛋白平板，恒温培养6个小时后测酶的活力。2.21纤溶酶的分离纯化粗酶液经离心除杂后，进行30%-60%硫酸铵分级盐析，盐析所得样品经OctylSepharose4FastFlow疏水相互作用层析分离，使用含30%饱和度硫

6、酸铵PBS缓冲液pH值7.4为进行梯洗，Phenyl-SepharoseHP疏水相互作用层析分离得到纤溶酶活性组分。采用纤维蛋白平板法测放线菌菌株发酵液的产纤溶酶活力，发现该株放线菌具有较强的产纤溶酶能力。2.22血纤维蛋白平板制备取0.125g琼脂糖加入27mL生理盐水中，加热溶解后置45℃水浴中保温30min后，加入500U/mL的凝血酶250μL，混匀。取1支80mg/支血纤维蛋白原溶于27mLHCl-巴比妥钠缓冲液(pH7.8)中，置45℃水浴中保温5min。分别取5mL凝血酶溶液与5mL血纤维蛋白

7、原溶液混合均匀后，快速倒入φ9cm平皿中，混匀，水平放置30min后置冰箱中备用。2.23酶活力的测定取恒温培养后的血纤维蛋白平板，用游标卡尺分别测出溶圈直径。相对活力=各浓度离子溶液的溶圈直径的平方/无离子溶液形成的溶圈直径的平方。3结果与讨论3.1测得数据如下离子离子浓度离子溶液酶的加入量溶液中的溶圈直径相对活力（mM）的加入量（ul）离子浓度（cm）（%）10.50.643119.1821.00.51375.85Cu2+520ul20ul2.50.45760.20105.00.40346.815齐齐哈

8、尔大学课程实验论文10050.00.0000.00010.50.51476.1521.00.50774.09Fe2+520ul20ul2.50.43153.55105.00.28723.7410050.00.30226.2910.50.53181.2821.00.713146.54Zn2+520ul20ul2.50.721149.84105.00.30326.4610050.00.0000.00010.50.57