兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

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1、兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定【关键词】骨髓间充质干细胞;兔;离心法,梯密度;,细胞培养技术　　［摘要］目的优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定，同时对其生物学性状进行研究。方法取新生新西兰大耳白兔骨髓5.0mL，采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对其进行纯化，观察细胞形态、超微结构和表面标志物的表达，从而对其进行鉴定。观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况，并绘制出生长曲线。结果经密度梯度离心、贴壁筛选并结合传代所得到的间充质干细胞很纯，第3代和第5代细胞形态单一，细胞排列具有典型的漩涡状结构。第1、3、5代细胞增殖能力强，生长旺盛;而第8

2、、10代细胞增殖明显减弱。所分离培养的细胞表达CD44、CD90，不表达CD34，电镜观察为低分化细胞。结论分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一，具有干细胞特性，第3、5代细胞很纯且其增殖能力强，适用于做以后的研究。　　［关键词］骨髓间充质干细胞;兔;离心法，梯密度;细胞培养技术　　［ABSTRACT］ObjectiveToexploretheapproachestoisolate，cultureandidentifythebonemarroesenchymalstemcells（BM-MSCs）ofrabbits.MethodsBM-MSCsthebonemarr

3、oL）oftheneicroscopyorphologicfeaturesandimmunocytochemis-trytoexaminetheexpressionofcellsurfaceantigens.Thegroorerapidlythanthoseof8thand10thgeneration.TheseculturedcellsshomunoreactivitytoCD44andCD90butnotCD34andloicroscopy.ConclusionPurifiedBM-MSCscanbeobtainedviathisprotocol.Cellsof1

4、st，3rd，5thgenerationent.　　［KEYSC）是一种具有多向分化潜能的干细胞，特定条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等细胞分化［1］。但骨髓中MSC的数量有限，含量极低，MSC所占的比例非常小，通常105～106个骨髓有核细胞中仅有1个MSC［2］。体外如何获取、纯化MSC并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提。本实验联合应用密度梯度离心和贴壁筛选的方法从骨髓中分离MSC并对其纯化，观察其在整个生命周期的形态、传代、增殖状态、细胞的超微结构及细胞表面抗原的表达，探讨体外分离培养MSC的生长规律，为大规模地获得生物学性状良好

5、的骨髓MSC，进一步研究骨髓MSC的诱导分化和应用奠定基础。　　1材料与方法　　　1.1实验动物新西兰纯种大耳白兔1只（2月龄），雌性，体质量3.0～4.0kg，由同济医学院实验动物中心提供，同济医学院附属协和医院实验动物中心饲养。　　　　1.2实验方法　　1.2.1MSC取材与原代培养将大白兔用3g/L戊巴比妥钠（1.0mL/kg）耳缘静脉麻醉后，侧卧手术台上，于髂后上嵴处剪毛备皮，体积分数0.01活力碘消毒，铺无菌洞巾，2g/L利多卡因手术部位局部麻醉。16号骨髓穿刺针接10mL注射器，穿刺进入骨髓腔，注射器内含稀释（3000kU/L）的肝素钠1.0mL，抽取骨髓

6、液约5.0mL。细胞分离培养及传代按文献［3］方法进行。　　1.2.2MSC的生长曲线描绘分别取第1、3、5、8、10代MSC，用2.5g/L胰蛋白酶消化后加入L-DMEM完全培养液，调整细胞密度至1.0×107/L，接种于5个24孔培养板中，培养板上作相应标记，每孔细胞悬液1.0mL。每天每板取3孔消化，形成细胞悬液，混匀，行细胞计数并计算均值，连续9d（消化8次）。然后以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。　　1.3MSC的鉴定　　1.3.1形态学观察在倒置显微镜下不定期观察细胞生长情况。　　1.3.2超微结构观察取生长状况良好的细胞2瓶，用2.5g/L胰

7、酶将细胞消化下来，800r/min离心5min，弃上清，加入约1.5mL的L-DMEM完全培养液重悬细胞，移至1.5mL的Ep管中，1500r/min离心10min，弃上清，可见Ep管底下方有一粒约芝麻大小灰白色团块，沿管壁小心加入25g/L戊二醛约1.5mL固定2h，再用锇酸溶液固定2h，乙醇梯度及丙酮脱水，环氧树脂包埋，做成超薄切片，醋酸钠及枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察其超微结构。　　1.3.3细胞表面标志鉴定收集第3代生长状况良好的细胞，传代培养于6孔板中行爬片，采用免疫化学ABC法检测CD34、CD44、CD90等抗原表达。　　2结果