大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定

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万方数据医学研究杂志2013年5月第42卷第5期·论善·————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一一大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定姚灿郏舜杰陈海啸洪盾朱敏范厉龙吕海燕摘要目的建立一套简单易行有效的骨髓间充质干细胞(BMscs)的培养、纯化、鉴定的方案，初步了解BMSCs的基本性状和功能特点。方法取4周龄雄性sD大鼠，全骨髓贴壁培养BMscs，对细胞相关的性状进行观察及分析，流式鉴定表面抗原，诱导其成骨、成脂分化，并进行染色鉴定等。结果流式检测结果cD29、cD90呈阳性反应，cD34、cD45呈阴性反应，成骨诱导分化后茜素红染色呈阳性反应，成脂诱导分化后油红染色呈阳性反应。结论全骨髓培养法是一种相对简单易行的BMSCs分离纯化的方法，可获得纯度高，活性好，性状均～的BMScs。关键词骨髓间充质干细胞原代培养分化s鉴定Isolation。cultureandldentificationofBoneMesenchymaIstemcellsofsDRatsinvitro．y口oCn凡，，iⅡJs^u强一e，C矗enHo血ido，^ro，tgDMn，e￡口f．7h如^ouHospi￡Ⅱf／坳fio￡ed￡DIF0，lz^ou肘ed站ozCoZZ89e，Z^E一口，蟛，J7DD0，c^i凡oAbstractObjectiveToestablishanefkctivemethodtocultivateandidentifyBMSCs，andtohaveapreliminaryunderstandingofthecharacteris“csoftheBMSCs．MethodsRatbonemarrowmesenchymalstemcellsoffourweeksoldSprague—Dawleywereinvitroi—solatedbywholebonemarrowadherencemethod．Cellmorphologywasobsenred，andexpressionsofCD34，CD45，CD29，CD90cellfactorswereexaminedbyflowcyt。metryanddifferentiationabilitywasdetectedt。identifywhetherit’stheBMSCs．ResultsCellsappearedspindle—shapedandshowedcharacteris“cswirlinggrowth．ThesuIfacemarkerCD34，CD45werenegative，CD90，CD29werepositive．After0steogenicandAdipogenicdifferentiation，Alizarinredand0ilRedstainingwaspositive．ConclusionWesuccessfullyIsoIatedthebonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)bythewholebonemarrowculturemethod，andfoundthatcellshadh培hpurityandgoodactivitywithin8thgeneration．Thewholebonemarrowculturewaseffctiveandeasy．KeywordsBMSC；P“maryculture；Differentiation；ldentifica“on骨髓间充质干细胞(BMSCs)是起源于骨髓支持结构的一群成体干细胞，具有自我更新、多向分化潜能。BMSCs在不同的诱导环境中可分化为骨细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌肉细胞、肝细胞样细胞、脂肪细胞等多种组织细胞，且BM．scs具有低免疫原性，成为组织工程首选种子细胞‘1’“。本研究应用全骨髓贴壁法，利用该细胞的黏附特性，贴壁分离BMSCs，传代并鉴定，建立一种较为简单、有效的BMsCs的培养方法，为本项目的进一步研究打下良好的基础。材料与方法1．材料：(1)实验动物：4周龄雌性SPF级sD大鼠(购于浙江省医学科学院)。(2)实验试剂：75％乙醇、PBs(Hy—e10ne)、MEM一仪培养基(Gibco)、胎牛血清(Hyclone)、胰蛋白酶(Gibco)、成骨诱导液(cYAGEN)、成脂诱导液(cYAGEN)、CD29(BD)、CD45(BD)、cD90(BD)、cD34(santacruz)、MTS(Promega)。(3)实验设备：无菌手术器械，移液器(Eppen．基金项目：国家自然科学基金资助项目(81171748)作者单位：317000临海，温州医学院附属台州医院dorf)，生物洁净工作台(苏净安泰)，离心机(湘仪)，4℃及一20℃s冰箱(海尔集团)，细胞培养箱(Thermoscientific)，倒置相差荧光显微镜(Leica)，RT6000酶标分析仪(Rayt0)，流式细胞仪(BDFAcscalibur)，一80℃超低温冰箱(Thermoscien—tific)，纯水仪(HealForce)，蒸发灭菌器(上海博讯)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，0．22斗m滤器(Millj—pore)，25cm2细胞培养瓶(Corning)，细胞培养板(corni“g)，离心管(corning)。2．方法：(1)BMsCs分离培养：取sD大鼠1只，颈椎脱臼法处死，浸泡于75％乙醇中约5一10min，无菌手术器械取出双侧股骨及胫骨，去除附着肌肉，将其浸泡于适量培养基中。取10ml针筒，在股骨及胫骨两端打各打2～3个孔，针筒吸取适量培养基插入一端干骺端，将骨髓中细胞冲至培养皿中，反复几次，直至股骨及胫骨发白，收集此细胞悬液，用200目金属滤网过滤去除稍大的杂质，将过滤后缅胞悬液收集至离心管中，800r／min，5min离心，弃上清，加人适量d—MEM培养基混匀，接种于两个25cm2塑料培养瓶中，于37℃，体积分数5％c0：饱和湿度孵育箱中培养48—72h后全量更换培养基，注意动作轻柔，此后每隔3天全量更换培养基1次。(2)BM·scs传代培养：约于9～12天后形成多个细胞集落，长满瓶底约70％～80％后可用0．125％胰酶消化，l：2传代培养。·67． 万方数据·论善·JMedRes，May2013，V01．42No．53．细胞生物学特性：(1)细胞形态观察：将不同代数的BMSCs接种于培养瓶中，每日用倒置相差显微镜观察细胞形态改变，并拍照记录。(2)绘制细胞生长曲线：分别将生长状态良好的第2、3、4代(以下简写成P2、P3、P4)BMscs以3×104／孔接种于24孔板中，置于细胞培养箱中培养，每隔24h各消化3孔，计数板上显微镜下计数，记录数值，l周后统计数据并以时间为横轴，细胞计数为纵轴制图。(3)细胞活性测定：取生长状态良好的P2一P8BMSCs，以1x104／孑L的密度接种于96孔板中，每孔100¨l，培养3天后，加入MTs，孵育2h后置于酶标分析仪检测490nm处吸光度值，记录数据并制图。4．BMSCs的鉴定：(1)流式表面标记鉴定：胰酶消化P4代BMScs，用PBs清洗3遍，计数细胞，重悬细胞后送至流式实验室检测表面标记cD34、cD29、CD45、cD90表达情况。(2)成骨分化能力鉴定：选择P3代细胞以1．5×105／孔的密度接种于六孔板中，选用Cyagen公司SD大鼠专用成骨诱导液，每隔3天全量更换诱导液，培养21天后进行茜素红染色，观察结果并拍照。(3)成脂分化能力鉴定：选择P3代细胞以1．5×105／孔的密度接种于六孔板中，选用Cyagen公司SD大鼠专用成脂诱导液，选用A液培养3天后改用B液培养24h，重复上述操作3次，然后以B液培养细胞6天，最后进行油红染色，观察结果并拍照。结果1．BMSCs形态：将骨髓细胞接种于培养瓶24h后，可见大量细胞悬浮，多数是红细胞，部分细胞贴壁，此时可观察到少量贴壁的BMSCs聚集成堆，形态不典型，成多角形(图1A呈不规则形，贴壁的为BM—sCs)。3天后全量更换培养基继续培养，约培养4～6天后可见贴壁细胞质开始舒展，呈梭形(图1B)。约9～12天后，BMScs细胞较为典型，呈梭形、网状，聚集生长(图lC)。j：≥：鬻蓉u口妙夕。尸_0’气≯雹6■J▲，。V§、一’．d舻j}B_图1不同培养和时间细胞形态观察A．原代培养24小时；B．原代培养3天；C．原代培养9天2．P2～P4代BMSCs生长曲线(图2)：P2～P4细胞接种最初的1—2天内细胞增殖缓慢，为潜伏期，3—6天进入快速增殖期，此后细胞密度显著增加，可能是由于接触抑制的原因导致增殖再次明显减慢，进入平台期。从图中也可发现随着代数增加其快速增长期的增长速度依次略有提高，这可能与后期细胞纯度增加有一定的关系。已60()()(1粤4()(】00辎捌崩20()oO0l⋯司(大)图2P2一P4代BMSCs生长曲线3．P2．P8代BMSCs的活性比较(图3)：所测数据经统计学分析，多样本均数间两两比较的9检验，·68·P>0．05，无统计学意义，即此次试验数据表明，P2一P8代BMsCs活性无明显差异。这对于试验具有一定指导意义。：。cS趔世芸昏2．O0．0绌JJf!!代数图3P2一P6代BMsCs细胞活性4．P4代BMSCs流式检测结果(图4)：CD29阳性率>99％，CD90阳性率>95％，CD45阳性率