外排泵msra在表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素耐药性中的作用

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1、外排泵msrA在表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素耐药性中的作用【关键词】表皮葡萄球菌物被膜红霉素耐药性0引言表皮葡萄球菌（简称表葡菌）引发的医院感染已得到人们的日益关注，虽然表葡菌分泌的毒性因子较金黄色葡萄球菌少，但其粘附在多聚材料上，形成生物被膜而引发的感染却呈现慢性、持续性、反复性和难治性的特点［1］.生物被膜的产生使膜内菌对抗生素的耐药性比浮游菌增加10～1000倍,其引发的感染常常只有移走植入物才能控制［2］，但其对抗生素的耐药机制目前还不十分清楚.外排泵msrA是浮游葡萄球菌对MLSB类抗生素耐药的主要机制之一,我们探讨外msrA在生物被膜内细菌对红

2、霉素耐药性中的作用如下：1材料和方法1．1限制缺陷型菌株StaphylococcusaureusRN4220，Staphylococcusepidermidis1457(产生物被膜,ica+,红霉素MIC0.25mg/L)和穿梭载体pBT2由美国MichealOtto教授惠赠；野生株S68（产生物被膜，msrA+,红霉素耐药MIC32mg/L）.根据msrA全长（GenBankNo.X52085），设计引物并在两端加SalⅠ和BamHⅠ酶切位点（F5′AAAAGTACTgatctttgtacttagagatat3′；R5′CGGGATCCgatcgg

3、ttatggtactattg3′），以菌株S68为模板扩增msrA,PCR反应条件：94℃5min，94℃1min，46℃1min，72℃90s，32个循环后，72℃7min.PCR产物凝胶纯化后，连于pMD18T载体并测序验证.将pMD18TmsrA质粒和pBT2质粒用SalⅠ和BamHⅠ双酶切后，将长度为2.0kb的msrA片段和6.9kb的pBT2质粒DNA片段连接后，转化入E.coliDH5α感受态细胞，用含Amp（100mg/L）和Em（20mg/L）的LB琼脂平板筛选，挑选菌落增菌提取质粒后，用SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定；同时PCR

4、扩增msrA鉴定.DL2000DNAmaker,Taq酶（DRR001A）和PCR试剂均购自TaKaRa公司.1.2.1S.epidermidis1457pBT2/msrA株的构建取S.epidermidis1457新鲜增菌液1mL接种于25mLBmedium（含蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖1g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾1g/L）37℃震荡培养至A600nm0.8.收集细菌用灭菌三蒸水和100mL/L甘油溶液洗涤后，用800μL甘油(100mL/L)溶液悬起，以每管70μL分装于灭菌Eppendorf管，-70℃保存.取-70℃保存

5、的金黄色葡萄球菌RN4220感受态细胞于室温融化.每管加入重组质粒pBT2+msrA6μL（100mg/L），轻轻混匀，室温放置30min，将细菌转入0.2cm电转杯，电击1次（电压2kV，电容25μF，电阻100Ω），通电时间约为2.4ms.迅速加入0.9mLBmedium悬起细菌，37℃震荡培养3h，取100μL涂于含Cm（20mg/L）的Bmedium琼脂平板，37℃倒置培养24h后，挑取克隆，接种到5mL含抗生素的LB液体培养基中，振摇培养12～16h，用Qiagen质粒抽提试剂盒提取质粒，SalⅠ和BamHⅠ酶切鉴定.采用Qiagenplasmi

6、dmidikit从金黄色葡萄球菌RN4220中提取50～100μg质粒，按上述方法电转化S.epidermidis1457感受态细胞，用含Cm（10mg/L）和Em（10mg/L）的Bmedium琼脂平板筛选阳性克隆.1.2.2S.epidermidis1457msrA的鉴定提取质粒用SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定.提取基因组DNA，PCR鉴定:msrA（1887bp）引物同前和icaA（814bp）引物为：5′GACCTCGAAGTCAATAGAGGT3′，5′CCCAGTATAACGTTGGATACC3′.95℃变性5min，95℃30s，5

7、0℃30s，72℃1min，30个循环后，72℃延伸7min；肉汤稀释法测量S.epidermidis1457和S.epidermidis1457msrA菌株的红霉素最小抑菌浓度,按常规方法操作，标准菌株StaphylococcusepidermidisATCC12228;采用KB纸片琼脂扩散法检测S.epidermidis1457和S.epidermidis1457msrA株对氨苄西林、苯唑西林、四环素、环丙沙星、庆大霉素、氯霉素的药物敏感性，根据抑菌环直径的大小按NCCLS（2005）标准判读.将S.epidermidi1457和S.epider

8、midis1457msrA株接种于刚果红［3］培养板，检测其产膜