海藻糖合成酶活性测定方法探究

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1、海藻糖合成酶活性测定方法探究摘要：目的研究一种测定海藻糖合成酶活性的方法。方法用薄层色谱法定性分析海藻糖合成酶反应体系中的海藻糖；用α-葡糖苷酶将麦芽糖水解为葡萄糖，DNS法测定还原糖，差值法计算海藻糖合成酶活性。结果获得了海藻糖合成酶活性的定性、定量分析方法，成功测定出粗酶液中海藻糖合成酶的活性。结论此方法设备简单，易于同时测定较多的样品，适用于实验室选育海藻糖合成酶产生菌时大量样品的测定。关键词：海藻糖合成酶；差值法；α-葡糖苷酶；薄层色谱中图分类号：Q559文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)05-0047-04

2、ResearchonActivityMeasurementofTrehaloseSynthaseDUANFeng1,GAOYan-hua1,YUANJian-guo2(1.JinanJingluBio-technologyResearchandDevelopmentCenter,Jinan250013,China;2.ShandongFood&FermentationIndustryResearch&DesignInstitute,Jinan250013,China)Abstract：ObjectiveToinvestigateamet

3、hodformeasuringtheactivityoftrehalosesynthase.10MethodsThequalitativeanalysisoftrehalosewasperformedbythinlayerchromatography(TLC);thequantitativeanalysisofactivityoftrehalosesynthasewasinvestigatedbythedifferenceofmaltoseandreducingsugarwhichwasfromthehydrolysisofmaltos

4、ebyα-glucosidaseandmeasuredbyDNS.ResultsThequalitativeandquantitativeanalysismethodswereobtainedfortrehalosesynthaseandtheactivityoftrehalosesynthaseincrudeenzymewasdeterminedsuccessfully.ConclusionThemethodissimpleandreasonable,cansimultaneouslydeterminemoresamplesandfi

5、tstothemensurationoflotsofsamplesduringtheselectionoftrehalosesynthase-producingstrainincommonlaboratory.Keywords：trehalosesynthase;differencemethod;α-glucosidase;thinlayerchromatography10海藻糖是由2个葡萄糖分子通过α-α，1→1键结合而成的非还原性双糖，结构稳定，化学惰性。海藻糖是优良的保鲜剂和保护剂，用于保存酶制剂、疫苗等生物制品效果显著，在食品、

6、化妆品、医药、保健食品等行业有广泛的应用价值。目前生产海藻糖有发酵法和酶转化法两种方法。酶转化法生产海藻糖成本低、产率高、原料来源广，其研究重点是酶的发酵生产及酶的固定化。目前海藻糖合成酶活性的检测主要用高效液相色谱等方法，不仅受实验室设备条件的限制，而且对样品的纯度要求很高，给研究工作带来一定的困难[1-4]。我们研究了海藻糖薄层色谱的定性检测方法，以及在海藻糖、麦芽糖、葡萄糖混合体系中用酶-DNS测定葡萄糖，差值法计算海藻糖的方法，成功测定出海藻糖合成酶的活性。1材料与方法1.1菌种水生栖热菌（Thermusaquaticus），本

7、研究室保藏。1.2主要原料和试剂海藻糖（Sigma公司）；培养基为生化试剂，薄层色谱用试剂为色谱纯，其他化学试剂无特殊说明均为分析纯，水为蒸馏水。DNS试剂：将3,5-二硝基水杨酸6.00g，氢氧化钠20.80g溶解于800mL蒸馏水中，依次加入酒石酸钾钠18.20g、重蒸酚5.00g、无水亚硫酸钠5.00g，定容至1000mL，于棕色瓶中暗处放置7d后，方可使用。1.3主要仪器7200型分光光度计；恒温水浴锅（±0.1℃）；高温摇床；高温培养箱；干燥箱；层析装置。101.4培养方法发酵培养基：牛肉膏0.5%，胰蛋白胨0.5%，硫酸铵0

8、.2%，硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.3%，磷酸二氢钾0.1%，pH8.3。65℃培养40h。1.5酶活测定方法1.5.1海藻糖合成酶活性的定义在60±0.1℃、pH6.80±0.05的0.05mol/L