香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的影响论文

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1、香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的影响论文韦继南,吴小涛,陈晓刚,王斌【摘要】目的：观察香豆雌酚对大鼠成骨细胞(OBs)增殖分化的影响，初步探讨香豆雌酚对OBs的作用机制。方法：用不同浓度香豆雌酚干预OBs，根据不同时间分别用酶消化法测碱性磷酸酶活性和羟脯氨酸含量、放免法测骨钙素含量及半定量RTPCR法检测OBs内OPG/RANKL基因的表达。结果:香豆雌酚呈浓度和时间依赖性促进大鼠OBs增殖及碱性磷酸酶表达;干预12h，各浓度组羟脯氨酸含量呈浓度依赖性增高，其中10-8mol·L-1作用最大(P=0.022)；培

2、养12h，OBs表达骨钙素呈浓度依赖性，24h达高峰，其中10-8mol·L-1有显著性差异(P=0.012).freelRNA，同时有抑制RANKLmRNA表达的作用，其在24h10-8mol·L-1浓度作用强度最大(P=0.038)，10-5mol·L-1则呈现抑制作用。结论:香豆雌酚能促进OBs的增殖分化，其作用呈浓度和时间依赖性，且至少部分有OPG/RANKL途径的参与。【关键词】香豆雌酚；成骨细胞；护骨素；骨质疏松；大鼠雌激素在绝经后骨质疏松的发生发展中起着十分重要的作用，绝经后雌激素替代疗法(hormone

3、replacementtherapy,HRT)曾被认为是绝经后骨质疏松治疗的金标准，但随着HRT所带来的阴道出血、乳腺癌、子宫内膜癌等风险大大限制了其临床推广应用1。近年来植物雌激素(phytoestrogen,PE)备受关注，它们的结构类似于17β雌二醇，能预防和治疗绝经后骨质疏松，但对子宫和乳腺无刺激作用2。动物实验表明，PE香豆雌酚能减少去卵巢大鼠骨丢失和骨吸收，增加骨密度3,有研究报道香豆雌酚能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟及骨吸收活性4，但其具体机制尚不清楚，对成骨细胞的作用也未见报道。为观察香豆雌酚

4、对成骨细胞的直接作用，本实验拟用香豆雌酚干预体外培养的新生大鼠成骨细胞，观察其对成骨指标的影响，初步探讨其对骨代谢的作用及其机制。1材料和方法1.1主要材料新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供）,LGDMEM(GibcoBRL),FBS(杭州四季青),ALP染色试剂盒(南京建成生物研究所),骨钙素试剂盒(北京科美东雅公司),TRIzol(KataraLtd.),RTPCRkit(MBILtd.),.freelestrol、Estradiol(SigmaLtd.USA),其余试剂均为国产分析纯。1.2细胞培养

5、1.2.1新生大鼠颅骨成骨细胞培养参照文献5将新生24h的SD大鼠放入75%酒精中浸泡5min,无菌取出颅盖骨，清除血管结缔组织,PBS洗涤。将颅盖骨剪成1mm3大小,0.25％胰蛋白酶37℃消化30min,弃去消化液,加入5ml0.1%Ⅰ型胶原酶消化60min,以200目筛网滤去骨渣，滤液1000r·min-1离心10min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM培养液并调整细胞密度，按1×105ml-1接种细胞于一次性无菌培养瓶中,置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。1.2.2成骨细胞鉴定1.2.2.1形态学

6、观察细胞培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况，药物干预前行台盼蓝染色观察细胞存活率。1.2.2.2碱性磷酸酶染色(改良Kaplom×5mm大小无菌盖玻片置于培养瓶中，细胞贴壁后取出盖玻片，按试剂盒说明书进行碱性磷酸酶染色。1.3观察指标1.3.1MTT细胞传代后按2.5×104ml-1接种于96孔板，2d后改为无血清培养液，24h后分别换为含0mol·L-1，10-10~10-5mol·L-1香豆雌酚的培养液,并设阳性对照组Estradiol(10-8mol·L-1),每种浓度重复７孔。在加药后12、2

7、4和48h分别取出1块培养板,每孔加入20μlMTT(5mg·ml-1)37℃继续培养4h，弃培养液,每孔加入200μlDMSO，5min后在酶标仪上490nm波长处测各孔吸光度值,结果用A490nm表示。1.3.2碱性磷酸酶细胞接种于6孔板，分组同上，干预12、24和48h后弃培养液，PBS清洗2次，每孔加入1ml0.1％TritonX100，反复吹打后1000r·min-1离心3min，酶消化法测上清液中碱性磷酸酶的含量。1.3.3羟脯氨酸细胞接种于6孔板，分组同上，干预12、24和48h后用酶消化法测上清液中羟

8、脯氨酸的含量(委托南京建成生物研究所检测)。1.3.4骨钙素细胞接种于6孔板，分组同上，干预12和24h后去掉培养上清，PBS清洗2次，加入1ml0.1％TritonX100，反复吹打后1000r·min-1离心3min，放免法测上清液中骨钙素的含量。1.3.5OPG/RANKL基因表达细胞接种于6孔板，分组同上，干预12、24