缺氧对大鼠成骨细胞增殖及凋亡的影响

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1、缺氧对大鼠成骨细胞增殖及凋亡的影响作者：顾九君，刘兴炎，盛俊东，白孟海，葛宝丰【摘要】目的探讨缺氧对体外培养成骨细胞增殖及凋亡的影响。方法应用MTT法、丫啶橙检测缺氧对体外培养成骨细胞的增殖及凋亡的影响。结果缺氧抑制了成骨细胞的增殖，且提高了成骨细胞的凋亡率，上述改变随着缺氧时间的延长而更加明显。结论缺氧具有抑制体外培养成骨细胞增殖，促进成骨细胞凋亡的作用。【关键词】缺氧；成骨细胞：细胞增殖；细胞凋亡骨折的基本危险因素之一是骨质疏松。最近，动物实验、流行病学和临床研究表明骨质疏松与血管损伤有关[1~5

2、]。有研究[6]指出，骨血流与骨塑形密切相关。研究发现，在股骨颈骨折患者的股骨头上，小动脉或毛细血管的数量显著减少[7]。在末端低血流的妇女中，跟骨的骨量丢失高达大约30%[8]。然而，对于上述发现的准确机制仍不清楚。在血管病理生理学中，缺氧是一个重要的因素，它可能会引起成骨细胞生物学行为的变化。因此，本实验通过研究缺氧对成骨细胞增殖及凋亡的影响，旨在探讨缺氧促进骨质疏松形成的作用机制。　　1材料与方法11细胞培养1．11成骨细胞的原代培养　　取新生(出生24h以内)EM培养液中培养，培养瓶置37

3、℃培养箱，24h换液。112培养细胞的鉴定　　(1)成骨细胞的形态观察。(2)成骨细胞的碱性磷酸酶染色[5]：细胞固定后入基质液(含2g/La萘基磷酸钠、2g/L坚牢蓝RR盐)，于37℃孵育15min，出现紫蓝色斑点后，弃基质液，流水冲洗，乙醇脱水，镜下观察摄像。(3)矿化结节染色：细胞固定后，用0．1%茜素红(alizarinredS)染色30min，蒸馏水洗3次，乙醇脱水，镜下观察摄像。　　1．2缺氧条件下培养成骨细胞　　12．1缺氧装置的构建[9]　　以橡皮塞密封培养瓶口，在橡皮塞上插

4、入两个9#针头分别作为进气、排气孔，高纯氮气通过装有二蒸水的已经高压灭菌处理的大烧瓶过滤后，经胶皮管与进气孔针头相连接，以1L/min的流量持续充入5min，随机从出气孔抽气进行血气分析，控制氧分压为2．5mmHg(1mmHg=0.133kPa)，密封。　　12．2缺氧培养方案　　取6瓶第2代细胞，分为A，B，C，（通讯作者：刘兴炎教授、博导，E-mail：Gujujun57343163.）D，E，F6组。更换无血清培养基，应用上述装置将A，B，C，D，E，F分为常氧组、缺氧1，2，3，4和5d组，

5、然后转入常氧培养，根据检测指标决定培养时间。1．3成骨细胞增殖率测定　　将干预后的细胞用0．25%胰蛋白酶液和0．02%EDTA消化收集细胞，调节细胞浓度为1×104/ml，于96孔板每孔加0．2ml，同时设空白对照组，只加入培养基。37℃培养24h后，弃取培养液，PBS洗1次，每孔加含10mlMTT的aMEM培养液，继续培养4h。弃去培养液，每孔加DMS0100ml，震荡，在酶联免疫检测仪上选择570nm波长，测每孔的光密度值(OD值)。1．4成骨细胞凋亡的丫啶橙染色　　（1）丫啶橙液的配制：10

6、mg丫啶橙溶于100PBS中，pH值4．8~6．0滤过，4℃保存。（2）将干预后的细胞培养满5d，吸去培养液，0．25%胰蛋白酶液消化，去消化液，含10%小牛血清的aMEM终止消化，反复吹打后细胞悬液移入离心管，1000r/min×5min离心，加入0．1MPBS液使细胞浓度为107/ml，取95μl的丫啶橙溶混匀，吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片：荧光显微镜选用激发滤片BG12，阻断滤片用515nm，镜下观察。（3）结果判断：荧光显微镜下，细胞核DNA为黄色荧光，细胞质和核仁的RNA为橘

7、黄或桔红色荧光。出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片。荧光显微镜下计数100个成骨细胞中凋亡细胞百分比。　　1．5统计学分析　　用SPSS9．0软件对实验结果进行分析，数据以平均数±标准差表示，组间比较采用t检验。　　2结果　　21成骨细胞的形态观察　　在倒置显微镜下可见成骨细胞传代12h后，细胞贴壁生长，外观呈梭形、三角形或鳞片形，以梭形细胞居多。培养第3天可见细胞形态仍以长梭形居多，细胞形态较接种初期稍显饱满，至培养第5天细胞增殖至基本覆盖培养皿底；至培养第

8、7天细胞完全覆盖皿底，且有细胞团块出现。　　22成骨细胞的碱性磷酸酶染色　　细胞胞浆内有紫蓝色沉淀并掩盖于细胞核上，染色呈强阳性。　　23矿化结节染色　　经过25d的培养，成骨细胞形成圆形矿化结节，橘红色，边界清晰。　　24成骨细胞增殖率测定　　实验结果表明，经过缺氧干预后，缺氧组的细胞增殖受到抑制，缺氧1d，2d，3d，4d，5d时的OD值明显低于正常氧组，各组与对照组比较差异有统计学意义(P<0．05)，各缺氧组之间差异亦有统计学意义(P