snt 2342.2-2010 苹果皱果类病毒检疫鉴定方法

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"#!!"!$%$苹果皱果类病毒检疫鉴定方法$%&%'&()*+*,(,%*&(-('+&()*)-+../%-01(&'0(*2/%3(0)(,!$%$4%%4$%发布!$%%4$&4$%实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局!"!#!"#!*!"!$%$前!!言!!!"!#$%&$标准分为两个部分"###苹果茎沟病毒检疫鉴定方法$###苹果皱果类病毒检疫鉴定方法%本部分为!"!#$%&$的第$部分%本部分按照'(!#)*)#$++,给出的规则起草%本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口%本部分起草单位"中国检验检疫科学研究院%本部

2、分主要起草人"李桂芬&魏梅生&张永江&马洁&相宁&李明福%!!"!#!"#!*!"!$%$苹果皱果类病毒检疫鉴定方法%!范围!"!#$%&$的本部分规定了苹果皱果类病毒检疫鉴定方法%本部分适用于带有苹果皱果类病毒的进境种苗或其他繁殖材料的检疫和鉴定%!!原理苹果皱果类病毒学名"-../01234562478/0942:4;'缩写"-<=>;%苹果皱果类病毒的特性是本标准制定的主要依据$该类病毒的分类地位&寄主范围&病害症状&地理分布&传播途径&基因组特征等参见附录-%"!仪器&用具和试剂"*%!仪器"*%*%!?=@扩增仪%"*%*!!电泳仪&电泳槽%"*%*"!水浴锅%"*%*#!高速冷冻离

3、心机%"*%*&!凝胶成像系统%"*%*'!振荡器%"*%*(!冰箱%"*%*)!电子分析天平(+*++)A)%"*!!用具"*!*%!可调移液器(+*)"B#$"B')"B#)+"B')+"B#)++"B')++"B#)+++"B)%"*!*!!可调移液器吸头%"*!*"!离心管%"*!*#!研钵%"*"!试剂"*"*%!$"%抽提缓冲液$+CC:/!B!#24DEF=/'.FG*+)+CC:/!B!乙二胺四乙酸二钠(=)+F)&"$HG"I$*$F$H)+*GC:/!B!氯化钠("I=/))J十二烷基磺酸钠(!K!)+*LJ二乙基二硫代氨基甲酸钠(KMN=-)$J聚乙烯吡咯烷酮(?>?'O

4、>$&+++E&++++)+*LJ巯基乙醇)!"!#!"#!*!"!$%$"*"*!!%$*#&'G,+CC:/!B!!#24DG,+C:/!B硼酸$+CC:/!B乙二胺四乙酸二钠(=)+F)&"$HG"I$*$F$H)调.F至G*%'加双蒸水定容至)B%"*"*"!加样缓冲液$P#(NQ+J!!甘油+*+QJ溴酚蓝+*+QJ二甲苯蓝"*"*#!固定液G,J水,*LJ乙醇)J冰乙酸"*"*&!染色液)A硝酸银加双蒸水定容至L++CB%"*"*'!显色液+*&C:/!B!!氢氧化钠&CB甲醛用双蒸水定容至)B%"*"*(!&$*#%'#24D!!!!!!!!!!!!!!!!!$&$*+A乙二胺四

5、乙酸二钠(NK#-*"I$*$F$H)%R*$A冰乙酸LR*)CB用双蒸水定容至)B%#!检疫鉴定方法#*%!往返聚丙烯酰胺凝胶电泳(()*+(,-.%/')#*%*%!$"%的提取#*%*%*%!取样"苹果苗木取枝皮部分'啤酒花取花或叶片%#*%*%*!!称取苹果枝皮&啤酒花的花或叶片样品(被检测样品&阳性样品###带有苹果皱果类病毒的植物材料&阴性样品###不带有苹果皱果类病毒的材料)$A'液氮充分研磨成细粉末%加入$倍体积的@"-抽提缓冲液'再加入$倍体积的水饱和苯酚'室温振荡混合%+C47')++++2!C47离心')+C47%#*%*%*"!取上清液'加等体积的苯酚E三氯甲烷()S)

6、)抽提一次')++++2!C47离心)+C47%#*%*%*#!取上清液'加入)!)+体积的%C:/!B的乙酸钠'$*L倍体积乙醇%TG+U'%+C47以上(或$!"!#!"#!*!"!$%$T$+U过夜)%#*%*%*&!)%+++2!C47离心)LC47%#*%*%*'!沉淀经RLJ冷乙醇洗涤'真空干燥后溶于双蒸水中%#*%*!!聚丙烯酰胺凝胶电泳#*%*!*%!凝胶制备聚丙烯酰胺凝胶浓度为QJ%在小烧杯中按顺序加入双蒸水$+*RRCB'%+J凝胶储备液QCB')+P#(N缓冲液%CB'#NONK%+"B')+J过硫酸铵(现配现用)$++"B%充分混匀后灌胶%然后插入样品梳%待胶完全凝聚后

7、在电泳槽内加入)P#(N电级缓冲液'然后轻轻拔掉梳子%#*%*!*!!预电泳加样前进行预电泳'电压)L+>')+C47%#*%*!*"!加样取)+"B提取的@"-样品(被检测样品&阳性样品&阴性样品)'按)S)的比例加入加样缓冲液%#*%*!*#!第一向电泳电极缓冲液为#(N'电压)L+>%当溴酚蓝移出凝胶板'二甲苯蓝接近胶底部时'停止电泳%#*%*!*&!第二向电泳弃去第一向电泳的电极缓冲液'先