羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子的表达

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1、羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子的表达【关键词】羊膜；角膜新生血管；血管内皮生长因子；角膜上皮细胞　　Abstract　AIM:TodetectthesuppressioneffectsofculturesupernatantofhumanamnioticmembraneontheexpressionofvascularendothelialgroalRCEcellsnioticmembrane(Ⅳgroup)culturesrespectively.Thenoneofplasticgroup(Ⅱgr

2、oup)anamnioticmembraneedium;anotherplasticgroup(Ⅲgroup)anamnioticmembraneedium;theothertFBSponents).After48hours,thetotalRNAsoftheseculturesRNAfromⅠgroupandⅡgroup,hoanamnioticmembraneedium)andⅣgroup(RCEcultereddirectlyonnakedamnioticmembrane)（P＜0.01,n=5）.CONCLUS

3、ION:AmnioticmembranetransplantationispartlythroughdepressingthemRNAexpressionofVEGFincornealcellstoreducethecornealneovascularizationofinjuriedcornealsurface.Anditmaybeanefficientmethodofcuringcornealneovascularizationinclinic.　　KEYEM培养基+甘油（V/V，1∶1）混合液，80℃低温冰箱

4、冷冻保存。使用时，将羊膜置于室温解冻,PBS液水化30min，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/LEDTA混合液在37℃消化30min，用细胞刮刀轻轻刮除羊膜的上皮层后，用PBS液漂洗3次，剪成4cm×4cm大小备用。将35mm培养皿的底钻掉，消毒后备用。将剪好的去掉上皮的羊膜的基底面向上，包于35mm培养皿上,用手术缝线固定。将羊膜为底的培养皿置于60mm培养皿中，加入少量DMEM培养基（含有150mL/L胎牛血清），于CO2细胞培养恒温箱中过夜。取经无菌处理的新鲜羊膜，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/LEDTA混

5、合液在37℃消化30min。以细胞刮刀将羊膜的上皮层细胞成分刮掉，将去上皮成分的4cm×4cm大小羊膜3块浸泡于制备好的无血清DMEM细胞培养基30mL中。作用48h后取其上清液待用。取经无菌处理的新鲜羊膜，保留其上皮层，将4cm×4cm大小羊膜3块浸泡于制备好的无血清DMEM细胞培养基30mL中。作用48h后取其上清液待用。　　1.2　方法　　兔处死后，立即将眼球取出，共30眼。用加有双抗的生理盐水漂洗3次，用剪刀取下透明的角膜部分，浸于生理盐水中，漂洗1次。用手术刀片去掉角膜的内皮层，其余组织上皮面向上移入7.5c

6、m玻璃平皿中，加入2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/LEDTA的混合液，37℃下消化25min后，用刀片将角膜的上皮层轻轻刮下，离心收集上皮细胞接种到25mL培养瓶中，以含150mL/LFBS的DMEM培养基培养，2～3d换液1次。培养7d致形成融合性生长，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/LEDTA的混合液消化后，分别传代接种于35mm培养皿和单纯去上皮羊膜为底物的培养皿组。用含150mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养传代细胞形成70%融合性生长后，将各组中的培养液换为无血清的DMEM培养液继续培养12h,以去除其它

7、活性成分的影响。实验分为4组，即Ⅰ组(对照组)：无血清的DMEM培养液，Ⅱ组：去上皮的羊膜培养液，Ⅲ组：未去上皮的羊膜培养液，Ⅳ组：将细胞直接接种于无上皮羊膜。每组设5个平行孔。12h后，接种于35mm培养皿的Ⅱ组中加入去上皮的羊膜培养上清液作为培养液,向Ⅲ组中加入未去上皮的羊膜培养上清液作为培养液，其余2组仍用无血清的DMEM培养基培养，培养48h后，去除各样本中的多余培养液，并向每个35mm培养皿样品中加入Trizol提取液1mL，最终RNA沉淀物加入DEPC水20μL充分溶解，80℃冷冻保存。PCR引物由TaK

8、aRa宝生物工程(大连)有限公司设计并合成,用灭菌水配成20μmol/L的溶液,4℃保存。引物序列：VEGF130bp，SenseTATTCAAGCCTTCCTGCGTG，AntisenseTGAGGTTTGATCCGCAT；βactin320bpSenseGCTGTCCCTGTACGCCTCTG，AntisenseTGCCGA