snt 2515-2010 牛结节疹检疫技术规范

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５１５—２０１０牛结节疹检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犾狌犿狆狔狊犽犻狀犱犻狊犲犪狊犲２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛结节疹检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２５１５—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张０．７５字数１５千

2、字２０１０年５月第一版２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０８２８定价１６．００元犛犖／犜２５１５—２０１０前言本标准的附录Ａ为规范性附录、附录Ｂ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邱杨、鱼海琼、林志雄、唐丽霞、赵丽、李艳霞、黄名秋。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５１５—２０１０牛结节疹检疫技术规范１范围本标准规定了牛结节疹电镜观察、病毒分离、血清中和试验等诊断方法。本标准适用于牛结节疹的检疫。２规范

3、性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３缩略语下列缩略词适用于本标准。３．１ＬＳＤ：牛结节疹。３．２ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸。３．３www.bzfxw.comＧＭＥＭ：Ｇｌａｓｇｏｗ改良Ｅａｇｌｅ’ｓ培养基。３．４ＣＰＥ：致细胞病变作用。３．５Ｈ＆Ｅ：苏木精伊红染色。３．６ＬＴ：羔羊

4、睾丸。３．７ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液。３．８ＮＢ：营养肉汤。３．９ＢＨＫ２１：幼仓鼠肾细胞。３．１０ＢＥＫ：牛肾细胞。３．１１Ｖｅｒｏ：非洲绿猴肾细胞。４试剂和材料４．１三蒸水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。４．２肝素或ＥＤＴＡ。１犛犖／犜２５１５—２０１０４．３１０％福尔马林。４．４含抗生素的ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ７．２）：配制方法见附录Ａ。４．５ＧＭＥＭ。４．６无水丙酮。４．７石蜡膜或蜡板。４．８ｐＨ７．８ＴｒｉｓＥＤＴＡ缓冲液：配制方法见附录Ａ。４．９ｐＨ７．８，１％磷钨酸：配制方法见附录Ａ。４．１０牛结节疹病毒Ｎｅｅｔｈｌｉｎｇ毒株。４．１１原代或

5、次代ＬＴ细胞。４．１２采用ＭＥＭ培养液，加１０％犊牛血清，２％水解乳蛋白，１００μｇ／ｍＬ青霉素，１００μｇ／ｍＬ链霉素，１００μｇ／ｍＬ制霉菌素。４．１３待检血清：无菌静脉采血，分离血清，并于５６℃灭活３０ｍｉｎ。４．１４阳性血清：同毒株来源。４．１５阴性血清：阴性牛场健康牛血清。５器材和设备５．１解剖镜。５．２水浴锅。５．３恒温箱。５．４普通冰箱和超低温冰箱。５．５台式离心机。５．６细胞培养板www.bzfxw.com。５．７细胞培养箱。５．８二氧化碳培养箱。５．９２０μＬ～２００μＬ微量移液器。５．１０倒置显微镜。５．１１电子显微镜。６电镜观

6、察６．１取新鲜的皮肤结节，制备组织悬液，用透射电镜观察。方法是：取一滴悬液于石蜡膜或蜡板上，将４００目六角形电子显微镜网格浮在其上，该网格具有绒毛状碳基质并在戊胺蒸气经光激活用。１ｍｉｎ后，将网栅转移到一滴ｐＨ７．８ＴｒｉｓＥＤＴＡ缓冲液中２０ｓ，然后，转到一滴ｐＨ７．８，１％的磷钨酸中，１０ｓ。用滤纸吸去水分，空干，置于电子显微镜下观察。山羊痘病毒粒子如砖状，周围覆盖有短管状结构，大小约为（２９０×２７０）ｎｍ，有些病毒粒子周围有宿主细胞膜包围，因此需尽可能多观察以确认病毒形态。６．２在电镜下，山羊痘病毒很难与正痘病毒区别，且其形态学上与牛痘和

7、痘病毒没有区别，但牛很少发生痘病毒和牛痘病毒感染，也不引起全身性感染，其他正痘病毒则均不引起牛发病。而副痘病毒在电镜下其形态小于痘病毒，呈卵圆形，外面有单个连续管状结构，像沟槽覆盖在病毒粒子周围，能与牛型山羊痘病毒区分开来。７病毒分离试验７．１样品的采集、送检和制备７．１．１血液样品的采集与制备在ＬＳＤ病毒血症期出现全身病灶之前或４ｄ内，采集血液，加入肝素或ＥＤＴＡ抗凝（用于病毒分离２犛犖／犜２５１５—２０１０的加有抗凝剂的血液样品应立即放置在冰浴上，最好尽快处理。样品在处理前４℃可放置２ｄ，但不宜冷冻或常温保存）。将抗凝血液以２０００ｒ／ｍｉｎ离

8、心１５ｍｉｎ，小心吸取上清液中含病毒的血沉棕黄层，无菌移入５ｍＬ冷双蒸水中，３０ｓ后，加入５ｍＬ冷的双倍浓度的生长培养基，