蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法

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1、《生物化学实验技术》课程作业蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量的方法[实验原理][器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.00mg/ml。2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按表1剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器

2、上混合。2.加完染料20min后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。3.用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算:样品蛋白质含量(μg/g鲜重)=以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。计算出回归方程。如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度SDS干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、

3、SDS、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。2.加完染料20min后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1考马斯亮蓝标准法实验表格第1页《生物化学实验技术》课程作业4共4页《生物化学实验技术》课程作业管号12345678910标准蛋白质（1.00mg/ml）00.010.020.040.060.080.10未知蛋白质（约0.5mg/ml）0.040.080.10蒸馏水0.10.090.080.060.040.0200.060.020考马斯亮蓝G-250试

4、剂3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0对应的吸光度A595　　　　　　　　根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。图1考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式y=ax+b计算所测溶液的蛋白质的含量。（二）SDS干扰数据和图表2考马斯亮蓝SDS干扰实验表格管号123456标准蛋白质（1.00mg/ml）0.10.10.10.10.10.1SDS(1mg/ml)00.10.20.40.60.8蒸馏水0.90.80.70.50.30.1考马斯亮蓝G-250试剂3.03.03.03.03.03.0对应的吸光度A5954共4页《

5、生物化学实验技术》课程作业根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。图2考马斯亮蓝SDS干扰实验理论上，十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰，随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。[结论]：1．考马斯亮蓝标准法测得未知溶液中蛋白质含量为xmg/ml。2．干扰考马斯亮蓝方法的物质中，SDS的干扰分析情况。[干扰实验结果分析]：当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。但是随着SDS浓度的增加，吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。从SDS与蛋白质的作用机

6、理来看，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。由于SDS的存在，阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合，使得吸光度减小。由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合，使得显色减弱，吸光度值降低，因此在曲线前段呈下降趋势；但由于SDS破坏氢键，使得蛋白质的空间结构更加伸展，一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来，所以会有少量的吸光度回升；但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“

7、饱和”时，过量的SDS就不起作用了，曲线是最后为平缓段。要去除SDS的干扰，可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除。K+对考马斯亮蓝方法不产生干扰。[思考与讨论]1.用考马斯亮蓝法G-250测定蛋白质含量有何特点，操作过程中应注意什么？4共4页《生物化学实验技术》课程作业答：Bradford法的优点是（1）灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。（2）测定快速、简便、只需要加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5min左右，颜色在5min至20

8、min之间