三七皂苷对人骨髓造血细胞凋亡相关蛋白表达的影响论文

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1、三七皂苷对人骨髓造血细胞凋亡相关蛋白表达的影响论文.freelanBoneMarroatopoieticCellsTreatedbyPanaxNotoginosidesAbstractThestudyedtoinvestigatetheactionofPanaxNotoginosides(PNS，extractedfromnotoginsengherb)ontheexpressionoftheapoptosis-relatedproteins(Daxx，Fas)andtranscriptionfactors(NFkB、c-Rel)in

2、thehematopoieticcellsandtoexplorethemechanismsofsupportingcellstosurvive.ThecolonyformationofCFU-GMandCFU-Einhumanbonemarroorphologyicroscope.TheAnnexin-VpositivecellsanmyeloidHL-60，erythroidK562，megakaryoidCHRF-288andMeg-01cellsg/L）for14days.Thenuclearorcytoplasmprotei

3、nofcellsonoclonalantibodiesagainstDaxx，FasorNFkB，c-Rel.Theresultsshoatopoieticprogenitorcells（CFU-GMandCFU-E）andfourcelllinesotedbyPNS;(2)afterthefourcelllinesotedbyPNSandhungeredthroughorphologicalchangeandneitherthedetectionofAnnexin-Vpositivecells;(3)theexpressionofD

4、axxandFasproteincouldbeinhibitedbyPNS.NC）凋亡增加，Fas和FasL表达也明显增高，提示AA患者的发病与Fas、FasL系统有关［1，2］。三七皂苷（PNS）是中药三七的主要活性成分，我们已报道了PNS能够刺激人骨髓红系、粒系造血祖细胞增殖和分化［3］，改善再生障碍性贫血小鼠的骨髓抑制并促进造血细胞增殖等［4］。本研究通过观察PNS处理前后对造血细胞凋亡相关的Daxx、Fas蛋白和核转录因子NFkB、c-Rel表达的影响，以探讨PNS促进造血细胞增殖，支持生长存活的作用机制，为临床应用提供可靠的

5、理论依据。材料和方法药物三七皂苷注射液半固体造血祖细胞集落培养及PNS刺激试验将正常的人骨髓标本按本室已建立的方法作粒系祖细胞（CFU-GM）、红系祖细胞（CFU-E）培养，体系分别含粒－单核细胞集落刺激因子10μg/L（Strathmann）或红细胞生成素2000U/L（麒麟鲲鹏中国生物药业），再加20％小牛血清（杭州四季青生物工程公司）和3g/L琼脂（Promega）的IMDM培养液。混匀后接种至24孔培养板，作3个复孔，均含105有核细胞/（0.5ml·l·g/L。培养7天后计数CFU-GM（40个细胞）、CFU-E集落（8个细

6、胞）和细胞株的集落（20个细胞）。人的造血细胞株液体培养及PNS诱导处理用HL-60、K562、CHRF-288和Meg-014种细胞株作为靶细胞，常规培养在含10%小牛血清的IMDM中，选择小剂量PNS（10mg/L）孵育细胞作为实验组，对照组不加PNS，培养2周后备用。台盼蓝染色、形态学观察和AnnexinV分析取培养2周后的细胞作饥饿处理，再加入较高浓度的PNS（30mg/L）刺激细胞2小时，然后分别作台盼蓝染色，计算细胞存活率。细胞悬液经离心涂片机制片，瑞氏染色，油镜下观察细胞形态。AnnexinV分析在细胞悬液中加入Anne

7、xinV-FITC5μl。避光孵育30分钟，用流式细胞仪分析AnnexinV阳性的凋亡细胞。细胞浆蛋白和核蛋白的提取取培养2周后细胞作饥饿处理，再加入较高浓度的PNS（30mg/L）诱导细胞2小时后，离心弃上清，用冷PBS洗涤后，悬浮在缓冲液A中含蛋白酶抑制剂（Sigma）:亮抑肽酶（leupeptin）、抗蛋白酶(antipatin)、抑蛋白酶肽(aprotinin)和抑胃酶(pepstatin)，均为10μg/ml，经振荡后破碎细胞膜，收集浆蛋白；将沉淀物即细胞核悬浮在含蛋白酶抑制剂缓冲液C中，超声波粉碎仪破碎细胞核，离心沉淀取上

8、清收集核蛋白。加入蛋白质显色剂(Bio-Rad)测定浆蛋白和核蛋白浓度，分装，-70℃保存备用。由于需要较长时间诱导细胞株，故先用低浓度PNS（10mg/L）作用14天，再用较高浓度PNS（30mg/L)刺激细胞2小时，