毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展

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1、doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.026毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。［关键词］毕赤酵

2、母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04ProgessofPichiapastorisEngineeringBacteriaonHigh-DensityFer⁃mentationXIAShan1,2,WUFu-Jun2,3,ZHAOHong-Liang2,XUEChong2,LIUZhi-Min2*1.SchoolofLifeScience,AnhuiUniservity,Hefei230039;2.BeijingInstituteofBiotechnology,Beijing100850

3、;3.ShanxiKangbaoBiologicalProductCo.Ltd,Changzhi046000;China*Correspondingauthor,E-mail:liuzhm@vip.sina.com［Abstract］Pichiapastorishasbeenutilizedwidelyasanexcellentheterologousgeneexpressionsystemrecently.High-densityfermentationhasbeenakeytechniquetachetoimprovetheexpressionleveloftheproteinofint

4、er⁃est.Inthispaper,weexpoundedthechooseofengineeringbacteria,designationandoptimizationofculturemedi⁃um,andcontroloffermentationcoursetoincreaseP.pastorisonhigh-densityfermentation.Moreover,thequestionsexistinginindustryhigh-densityfermentationwereputforward.［Keywords］Pichiapastoris;high-densityfer

5、mentation;courseoptimizationofculturemedium;controloffermentation20世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。近20年来，毕赤酵母大规模培养已成为生物制药领域非常重要的关键技术之一，并不断推动生物技术产业的迅速发展。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有非常明显的优势，这是因为毕赤酵母本身为单细胞真核生物，易于分子遗传学操作，且外源基因可以整合到酵母的染色体上，随染色体一起复制和遗传，不易造成外源基因的丢失现象；具有强诱导性和强启动性的醇氧化酶基因启动子，适用

6、于外源基因的高水平诱导表达；并且毕赤酵母在高水平表达外源蛋白的同时，自身背景蛋白分泌却很少，不需要破菌等复杂操作，有利于后续纯化；毕赤酵母发酵产物的积累不会对自身宿主菌产生大的毒副作用，这更有利于大规模的高密度发酵。目前，越来越多的国内外研究者选择毕赤酵母作为外源蛋白的优先表达系统，表达产物包括干扰素、白介素2、抗体等[1-3]，且已有产品上市。尽管毕赤酵母有自身的优点，但对于不同的具体目标产品，表达水平参差不齐。如胞内分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶的产量高达22g/L[4]，破伤风片段C产量高达12g/L[5]，胞外分泌表达的明胶的产量达到14.8g/L[6]等，而最低的报道只有1mg/L，

7、其间相差可达10000倍。因此，要提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵（high-densityfermentation）也成为一个关键技术环节。1毕赤酵母工程菌的选择和改良1.1工程菌的选择目前毕赤酵母工程菌株常常呈现2种表型，分别为mut+和muts，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢（methanolutilizationslow，muts或mut-），它们只能利用弱的aox2基因启动合成