产β-甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌的改造及发酵条件优化

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1、万方数据中图分类号Q墨!墨UDC663硕士学位论文学校代码密级10533公开产p一甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌的改造及发酵条件优化ReconstructionandOptimizationofFermentationConditionsofRecombinantPichiapastorisProducing13-mannanase作者姓名：学科专业：研究方向：学院．(系、所)：指导教师：王冶生物学生物工程资源加工与生物工程学院周洪波教授答辩委员会主席中南大学2014年5月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导

2、师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确．的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：≥碡日期：业年』月工日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅

3、；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：刁、／勿日期：址年上月工日撤噼盈牛趣毕签艮磁期万方数据硕士学位论文摘要产p．甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌的改造及发酵条件优化摘要：p．1，4一D一甘露聚糖ig叠s(endo．1，4．D-mannanase，EC3．2．1．78)是一种广泛应用于饲料和食品等行业中的半纤维素水解酶，具有重要经济价值。本研究将组成型产D．甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌中的仪．factor信号肽替换成五种新信号肽(W1

4、、MF4I、INUlA、apre、HFBI)。对比伐．factor信号肽，Wl、MF4I、ctpre、HFBI信号肽改造菌株的相对酶活分别达到23．5％、203．5％、79．7％和120．3％，INUlA无胞外D．甘露聚糖酶活性。通过RT-PCR对p．甘露聚糖酶基因拷贝数进行测定的结果表明0【．factor和MF4I两种重组子的MAN活力均于4个拷贝数时达到最大。替换MF4I信号肽的重组子在1-6个MAN基因拷贝数的水平上对比u—factor信号肽的重组子，提高的MAN活力分别达到66．30U／m1、90．56U／ml、133．37

5、U／ml、173．97U／ml、102．92U／ml、102．26U／fml，相对酶活分别达到512．0％、209．0％、105．3％、100．2％、99．7％、105．2％。4个拷贝数的MF4I重组子MAN活力相对最大，可以达到347．5删。选用SⅧ1168作为表达宿主的重组子的平均酶活只能达到X33宿主型的62．7％．64．1％。而将pPICZa-MAN质粒中的Q．factor进行MF4I信号肽改造，重新构建得到的诱导型pAOXlMF4I一此删基因工程菌的酶活可以达到原来组成型pGAPZMF41A-删Ⅳ基因工程菌中酶活最高水平的

6、2．3倍，将其用于下一步高密度发酵。经单因素实验摸索发酵基础培养基氮源和碳源分别为279／L的玉米浆干粉和20g／L的食品级葡萄糖，并在诱导流加培养基中新添加2g／L硫酸铵和O．5g／L油酸。综合信号肽和启动子改造优化后的产B．甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌经5L发酵罐高密度发酵后，产出的D。甘露聚糖酶最高活力从摇瓶的173．35U／ml提高至6890U／ml，总体提高幅度达到39．7倍。关键词：p-甘露聚糖酶；毕赤酵母；改造；信号肽；表达宿主；启动子；发酵条件优化分类号：Q815万方数据硕士学位论文AbstractReconstruct

7、ionandOptimizationofFermentationConditionsofEngineeringPichiapastorisProducing[I-mannanaseAbstract：Endo．D．mannanase(EC3．2．1．78)isanendohydrolasewithgreateconomicimportance，whichCanbewidelyappliedinfoodprocessingindustryandfeedproduction．Inthisstudy,theCc—factorsignalpe

8、ptideinconstitutiveexpressionvectorpGAPZaAwasreplacedbyfiveothersignalpeptides(Wl，姗4I，INUlA，apre，HFBI)．Therelativeact