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1、丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法应用探析【摘要】目的探讨丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的应用。方法分析包括血液筛查阴性标本420份,质控标本430份。结果对240份HCV抗体阳性标本进行检测,双抗原夹心法检测有3份标本未检出。3份样本经ChironRIBA确认试剂检测,结果为阳性。敏感性较高99.85%。结论双抗原夹心丙型肝炎病毒抗体酶联免疫诊断试剂对所检测的质控标本的检测总符合率达99.85%,且敏感性和特异性均较好,有望用于临床血液标本的筛查。【关键词】丙型肝炎;病毒抗体双抗原夹心法;应用作者单位:455000河南
2、省安阳市妇幼保健院检验科HCV是输血后肝炎的重要病因,主要通过血液或血液制品传播,HCV感染呈世界性分布,我国感染者约有4000万,为控制HCV经血液传播,要求对献血者进行抗-HCV的检测。常用的抗-HCV检测试剂均采用间接酶联免疫法,该方法中包被抗原的组成和质量是关键因素。近年来对抗-HCV间接酶联免疫法试剂单独检测阳性,且在临界值附近的样本,用双抗原夹心酶联免疫法试剂检测均为阴性,我们建立了双抗原夹心ELISA方法[1]。改进HCV的血清学诊断,取得良好的效果,现汇报如下。1材料和方法51.1血清标本包括血液
3、筛查阴性标本420份,质控标本430份。1.2抗原的制备嵌合表位抗原包括HCV-NS3-C-NS4-NS5,以包涵体形式表达,通过SP-SepharoseFF或Q-SepharoseFF离子交换层析进行纯化,将所收集的洗脱峰再用SephadexG-50柱凝胶过滤,SDS-PAGE鉴定抗原蛋白。1.3试剂吉比爱及Ortho丙肝病毒抗体酶联免疫诊断试剂检测。ChironRIBA确认试剂。1.4双抗原夹心法用50mmol/LpH916碳酸盐缓冲液(包被液)稀释抗原至工作浓度。多肽抗原工作浓度为:结构区多肽15Lg/ml
4、,NS4区多0.5Lg/ml,NS5区多肽0.25Lg/ml。基因工程表达抗原工作浓度C7和C11均为1μg/ml。每孔加100μl,置37℃保温1h后于4℃过夜。用含30%小牛血清PBST封闭,每孔加200μl,置37℃保温1h。倒掉封闭液,每孔加50μl样品稀释液,5μl样品,置37℃30min。用PBST洗板5次。用棋盘滴定法选择最适酶稀释度,用稀释液将酶标记抗原稀释至工作浓度。每孔加50μl,置37℃保温15min。PBST洗板5次。每孔加底物缓冲液50μl,显色剂(TMB)50Ll,置37℃显色10mi
5、n。每孔加2mol/LH�2SO450μl终止反应,在LabsystemsMultiskanMS型酶标仪于450nm测吸光度A值,标本4505nm的A值大于或等于临界值(Cutoffvalue)者为阳性,反之为阴性。2结果对240份HCV抗体阳性标本进行检测,双抗原夹心法检测有3份标本未检出。3份样本经ChironRIBA确认试剂检测,结果为阳性。敏感性较高99.85%,见表1。表1240份HCV抗体阳性标本检测结果双抗原夹心�试剂检测法样本数阳性阴性合计阳性23010240阴性10600610合计2406108
6、503讨论HCV是输血后肝炎的重要病因,主要通过血液或血液制品传播,HCV感染呈世界性分布,我国感染者约有4000万,为控制HCV经血液传播,要求对献血者进行抗-HCV的检测。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗-HCV抗体是丙型肝炎病毒(HCV)5感染诊断的主要方法。目前的抗-HCV酶联免疫诊断试剂均采用二抗作酶结合物[2-3],由于血清中IgG含量高,故少量的非特异吸附即可造成假阳性结果,血清中类风湿因子等也可能干扰检测结果,且实验操作较繁琐,检测时间较长。检测HCVRNA的PCR法虽可进行早期诊断,但费时、
7、费力,且试剂昂贵,均较难普及。由于双抗原夹心法不需要稀释血清产品,不受类风湿因子等的干扰,具有较高的特异性;可以同时检出血清中各类抗体,特别是IgM类抗体,因此可以缩短从病毒感染到用ELISA法检出抗体之间的“窗口期”。建立双抗原夹心ELISA对于提高HCV感染诊断试剂的特异性和检出率,缩短检测时间,均有重要意义[4]。阳性标本的结果均为阴性,表明该试剂检测丙型肝炎病毒抗体试剂具有很好的特异性。HCV抗体阳性的240份标本有3份未检出,这3份样本使用国产吉比爱和Ortho间接丙肝病毒抗体酶联免疫诊断试剂的检测结果
8、也均为阴性,经ChironRIBA确认试剂检测后,结果为阳性,分析其原因可能为酶联试剂所采用的HCV抗原为嵌合表达的抗原,而ChironRIBA确认试剂是将HCV抗原分别表达并固定于膜上,检测针对4个抗原的HCV抗体,结果判断与酶联法不同,另外酶联试剂与RIBA确认试剂所用抗原也有一定的差异。双抗原夹心丙型肝炎病毒抗体酶联免疫诊断试剂对所检测的质控标本的检测总符合率达99
