鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达论文

鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达论文

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1、鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达论文胡权,张正茂,张小勇,张振华,雷延昌,周敦金,黄建国,杨东亮【摘要】目的构建鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染性克隆,通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法以湖北麻鸭DHBV分离株(DQ276978)为模板,用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒(pMD-DHBV)和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段,总长44kb,克隆至载体PCR21的SacI和NotI酶切位点,构建含15倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒,并酶切鉴定其插入方向。将构建的重组质粒经脂质体LipofectineTM200

2、0导入鸡肝癌细胞系(LMH)细胞中转染表达,收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定.freelRNA编辑酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表达质粒共转染LMH细胞,通过抑制实验以证实该DHBV体外实验模型的初步应用。1材料与方法11材料111质粒pMD-DHBV为本实验室构建的含有湖北麻鸭(DQ276978)DHBVDNA全长基因组的质粒;pSP65-DHBV16为双拷贝头尾相接的全基因DHBVDNA重组质粒,该克隆质粒(美国Mandart教授馈赠);APOBEC3G真核表达质粒为本实验室构建保存

3、;PCR21载体(美国Invitrogen公司)。112DHBV阳性血清取自扩增出DHBVDNA全长基因组(DQ276978)的阳性血清。113细胞禽类鸡肝癌细胞系LMH,为本室传代保存。114工具酶LATaq酶、限制性内切酶EcoRI、BamHI、SacI、KpnI、NotI及凝胶回收试剂盒(大连TAKARA公司);TaqDNA聚合酶(美国Promega公司);T4DNA连接酶(美国GIBICO公司)。115生化及其它试剂地高辛(DIG)标记及检测试剂盒(德国Roche公司);2000(美国Invitrogen公司)。DNA凝胶回收试剂盒、

4、PCR产物回收试剂盒(德国QIAGEN公司);质粒提取试剂盒和动物培养细胞基因组DNA纯化试剂盒(大连TaKR公司)。12方法通过对湖北麻鸭(DQ276978)DHBVDNA的全长克隆质粒的序列限制酶切图谱分析〔1〕,已明确其基因组的结构及与复制相关的重要元件的序列位置,在此基础上运用3片法构建出能自我复制的重组质粒。121构建质粒PCR21-DHBV15用EcoRI和BamHI双酶切pMD-DHBV,得到目的片段DA(DHBV3024/0nt-1473nt);设计引物DB1/DB2和DC1/DC2分别经PCR扩增DHBV阳性血清获得目的片段DB(1

5、473nt-2870nt)和DC(1395-3024/0nt)。将上述3片段插入PCR21的相应酶切位点后即得到15倍DHBV全基因重组质粒PCR21-DHBV15。122PCR鉴定引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2为DHBV基因S区和C区的高度保守序列段,引物序列如下:Ps1(1318F)5′-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3′,Ps2(1739R)5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3′;Pc1(187F)5′-GCAATCACTAGACCAATCCA-3′,Pc2(397R)5′-GAGATCTATGGTGGCTGCT

6、C-3′。PCR反应液组成:10×Buffer5μl;MgCl2(25mmol/L)3μl;dNTP(10mmol/L)1μl;Ps1/Ps2或Pc1/Pc2各1μl;Taq酶1μl;DHBV模板5μl;加灭菌纯水至50μl。PCR循环参数:94℃5min;94℃50s,61℃45s,72℃50s,40个循环;72℃10min。123酶切鉴定用BamHI,SacI和EcoRI,NotI和EcoRI,SacI和BamHI分别进行酶切鉴定。124序列测定取一株阳性克隆质粒送上海生物工程技术服务公司测序。125脂质体LipofectineTM2000介导

7、的DNA转染在LMH细胞达到80%~90%融合时进行转染,设未转染LMH细胞对照和pSP65-DHBV16质粒对照。126蛋白印迹(SouthernBlot)分析提取转染LMH细胞内总DNA后,用DIG标记的DHBV全长基因组探针杂交,X-ray胶片发光显影。127转染细胞上清液中病毒颗粒电镜观察收集转染细胞的上清液,离心后用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解沉淀,将该沉淀溶解物通过磷钨酸负染法进行电镜观察。128APOBEC3G真核表达质粒对DHBV的抑制效应实验质粒PCR21-DHBV15分别与不同剂量(20和40μg)的APOBEC3G真核表达质

8、粒pXF3G-HA通过Lipofect

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