鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达

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1、鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达作者：胡权，张正茂，张小勇，张振华，雷延昌，周敦金，黄建国，杨东亮【摘要】目的构建鸭乙型肝炎病毒感染性克隆，通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法以湖北麻鸭DHBV分离株为模板，用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段，总长44kb，克隆至载体PCR21的Sacl和NotI酶切位点，构建含15倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒，并酶切鉴定其插入方向。将构建的重组质粒经脂质体LipofectineTM2000导入鸡肝癌细胞系(LMH)细胞中转染

2、表迗，收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定，证实成功获得正向插入的倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒。Southernblot检测表明，该重组质粒在LMH细胞内存在各种病毒复制中间体；通过电镜观察，转染细胞上清液中存在DHBV完整病毒颗粒。结论经体外重组，构建出携带倍加长DHBV基因组片段的重组质粒PCR21-DHBV15,并可在鸡肝癌细胞LMH中介导高水平病毒复制，从而获得含可自我复制病毒颗粒的转染细胞上清液作为动物体内感染接种物。【关键词】鸭乙型肝炎病毒鸭乙型肝炎病毒与人类乙型肝炎病毒同

3、属嗜肝DNA病毒科，它们在形态结构、基因序列、病毒复制、致病机制及感染宿主规律等方面均较为相似，DHBV感染鸭模型使人们认识了嗜肝病毒的复制周期以及病毒持续存在和病毒彻底清除的机制。我们在对湖北麻鸭DHBV自然感染率调查的基础上，选择对DHBV易感且取材方便的湖北麻鸭作为实验鸭种，并分离出1株DHBV新毒株（1）。进而以该毒株为模板，构建了15倍DHBV全基因重组质粒，通过该质粒在鸡肝癌细胞系（LMH）中稳定转染表达出含有可自我复制的病毒颗粒的细胞培养上清液作为单一来源、基因序列清楚的实验毒种，以期建立标准化的湖北麻鸭乙型肝炎病毒体内模型。另

4、外，将该DHBV重组质粒与不同剂量人类载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽3G（APOBEC3G）真核表迗质粒共转染LMH细胞，通过抑制实验以证实该DHBV体外实验模型的初步应用。1材料与方法11材料111质粒pMD-DHBV为本实验室构建的含有湖北麻鸭DHBVDNA全长基因组的质粒；pSP65-DHBV16为双拷贝头尾相接的全基因DHBVDNA重组质粒，该克隆质粒（美国Mandart教授馈赠）；APOBEC3G真核表迗质粒为本实验室构建保存；PCR21载体（美国Invitrogen公司）。112DHBV阳性血清取自扩增出DHBVDNA全长基因组

5、的阳性血清。113细胞禽类鸡肝癌细胞系LMH，为本室传代保存。114工具酶LATaq酶、限制性内切酶EcoRI、BamHI、Sacl、Kpnl、NotI及凝胶回收试剂盒（大连TAKARA公司）；TaqDNA聚合酶（美国Promega公司）；T4DNA连接酶（美国GIBIC0公司）。115生化及其它试剂地高辛（DIG）标记及检测试剂盒（德国Roche公司）；Waymouth细胞培养基（美国Sigma公司）；LipofectineTM2000（美国Invitrogen公司）oDNA凝胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒（德国QIAGEN公司）;质粒

6、提取试剂盒和动物培养细胞基因组DNA纯化试剂盒（大连TaKR公司）。12方法通过对湖北麻鸭DHBVDNA的全长克隆质粒的序列限制酶切图谱分析〔1〕，已明确其基因组的结构及与复制相关的重要元件的序列位置，在此基础上运用3片法构建出能自我复制的重组质粒。121构建质粒PCR21-DHBV15用EcoRI和BamHI双酶切pMD-DHBV，得到目的片段DA;设计引物DB1/DB2和DC1/DC2分别经PCR扩增DHBV阳性血清获得目的片段DB和DC。将上述3片段插入PCR21的相应酶切位点后即得到15倍DHBV全基因重组质粒PCR21-DHBV15

7、。122PCR鉴定引物Psl/Ps2和Pcl/Pc2为DHBV基因S区和C区的高度保守序列段，引物序列如下：Psl57-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3z,Ps25,-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3';Pcl57-GCAATCACTAGACCAATCCA-37，Pc25'-GAGATCTATGGTGGCTGCTC-3'。PCR反应液组成：10XBuffer5ul；MgC123ul;dNTPlul;Psl/Ps2或Pcl/Pc2各1ul；Taq酶1y1;DHBV模板5y1；加灭菌纯水至50nloPCR循环参数：94°C

8、5min；94°C50s，6l°C45s，72°C50s，40个循环；72oC10mino123酶切鉴定用BamHI，SacI和EcoRI，NotI和EcoRI，S