酶活测定方法.doc

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1、二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。二、基本原理多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、苹果、马铃薯等。（二）仪器及用具研钵、高

2、速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL）。（三）试剂1．100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。2．提取缓冲液（含1mMPEG、4%PVPP和1%TritonX-100）称取340mgPEG6000（聚

3、乙二醇6000）、4gPVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1mLTritonX-100，用100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100mL。3．50mmol/L邻苯二酚称取275mg邻苯二酚，用50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50mL。四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。（二）活性测定取一支试管，加入4.0mL50mmol/L、p

4、H5.5的醋酸缓冲液和1.0mL50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100µL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长420nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。五、实验结果与计算1．将测定的数据填入下表重复次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)420nm吸光度值样品中PPO活性(△OD420·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD计算值平均值±标准偏差12

5、32．计算结果记录反应体系在420nm处的吸光度值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD420。然后以每克鲜重（FW）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位（U），则U=△OD420·min-1·g-1FW。计算公式：式中：△OD420——反应混合液的吸光度变化值；△t——酶促反应时间，min；V——样品提取液总体积，mL；Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；W——样品重量，g。PPO活性还可以每分钟反应体系在波长420nm处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位（U），表示为U=△OD

6、420·min-1·mg-1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。六、注意事项应进行预实验，测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化（初级反应）的时间段。这样，只测定某一段时间内反应溶液的初始吸光度值（OD0）和最终值（ODt）这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值变化的增加量。七、思考题随着反应时间的延长，多酚氧化酶活性将呈现什么样的变化？（四）超氧化物岐化酶活性测定一、目的要求学习果蔬组织中过超氧化物歧化酶活性的测定原理和方法。二、基本原理超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）普遍存

7、在于动、植物与微生物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧自由基（O2-），它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对有机体的毒害。超氧阴离子自由基（O2-）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。H2O2再由CAT进一步催化生成H2O和O2。超氧化物岐化酶催化以下反应：由于超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般利用间接方法测定SOD活性。本实验依据SOD抑制

8、氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小