BudABudBBudC酶活测定方法.docx

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1、5%的α–萘酚溶液：准确称取0.5g的α–萘酚，用2.5mol/L的氢氧化钠溶液溶解并定容至10mL。0.5%的肌酸溶液：准确称取0.5g的肌酸，用2.5mol/L的氢氧化钠溶液溶解并定容至100mL。10mM的焦磷酸硫胺素溶液：准确称取0.461g焦磷酸硫胺素，用蒸馏水溶解并定容至100mL。4mM的FAD溶液：准确称取0.033gFAD，用蒸馏水溶解并定容至10mL。0.1M的MgCl2溶液：准确称取0.952gMgCl2，用蒸馏水溶解并定容至100mL。0.4M的丙酮酸钠溶液：准确称取4.402g丙酮酸钠，用蒸馏水溶解并定容至100mL

2、。1M的乙偶姻溶液：准确称取4.406g乙偶姻，用蒸馏水溶解并定容至50mL。1MDTT溶液：称取3.09gDTT，加入20mL0.01MNaAc（pH5.2），搅拌溶解后，适量分成小份，-20℃保存。2.3.7.3乙酰乳酸脱羧酶酶活的测定（1）3-羟基丁酮标准曲线绘制过程如下：配制0.lg/L的3-羟基丁酮标准溶液，取6个1.5mL离心管，每管中依次加入0、100、200、400、600、800、1000µL的3-羟基丁酮标准溶液、然后用蒸馏水补至1000µL。各取400uL上述浓度的3-羟基丁酮，向其中加入4.6mL0.5%肌酸溶液和5%

3、的α-碱萘酚溶液，60℃下温育15min，测OD525值，每管做3个平行，标准曲线见图2-5。（2）测定方法:反应总体积400µL，其中200µL为新配制底物α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯，用200µLpH6.0的0.03mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液适当稀释的酶样置于30℃水浴20min；加入4.6mL显色剂(0.1%肌酸，1%α-萘酚，溶于1mol/LNaOH溶液中，临用前配)，以中止反应和显色，混合后在室温（约15~20℃）下显色50min，在分光光度计上于525nm处测吸光度，根据吸光度计算酶活单位。一个酶活单位定义为：在37℃

4、，pH6.0条件下，每分钟产生1mmol3-羟基丁酮的酶量为一个酶活单位。比酶活单位为mmol/min/mg。2.3.7.4乙酰乳酸合成酶酶活的测定37℃下，单位时间内(min)，单位质量(mg)酶蛋白催化合成的a-乙酰乳酸的量(µmol)，作为a-乙酰乳酸合成酶的一个比酶活单位U/mg（µmol/mgmin）。具体过程如下：1.5mL反应混合物（含24mmol/L丙酮酸钠，0.6mol/LMgCl2，1mmol/LTPP，20mol/LFAD，pH7.0的50mmol/L2HPO4-KH2PO4的缓冲液）及1.2mL粗酶液的体系在35℃恒温

5、水浴中暗反应1h，用0.1mL3mol/LH2SO4终止反应，60℃脱羧15min。使反应过程中形成的a-乙酰乳酸在酸中加热不断脱梭形成3-羟基丁酮或丁二酮。用2.3.7.4的方法进行显色反应，加入200µL0.5%肌酸溶液和200µL5%的α-碱萘酚溶液，在60℃下反应15min，525nm测OD值。2.3.7.2乙偶姻还原酶酶活的测定取5µL无细胞抽提液加入混合反应物（含2.8mLpH6.5的0.1M磷酸缓冲溶液，30µL33mM的NADH溶液和150µL1M乙偶姻溶液。在乙偶姻还原酶的作用下NADH被氧化，紫外分光光度计检测一定时间内反

6、应液340nm的吸光度的减小值以不NADH稀释不同的倍数，在340nm下测定吸光度，对照吸光度和NADH浓度的标准曲线，得NADH浓度。乙偶姻还原酶酶活定义为：每分钟每毫克总蛋白氧化NADH转化为NAD+的µmol量，单位为µmol/min/mg。加酶液的混合反应体系为空白对照。