免疫组织化学技术

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1、免疫组织化学技术http://www.keygentec.com.cn免疫组织化学技术基本原理通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原—抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。组织与细胞材料的制备免疫组织化学方法组织与细胞材料的制备组织石蜡切片制作组织冰冻切片制作细胞爬片制作细胞涂片制作切片的制作组织的固定组

2、织石蜡包埋切片目的:（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产

3、生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。组织材料的固定固定液的选择：(1)甲醛固定液：10％福尔马林，10％中性福尔马林，10％中性缓冲福尔马林(2)4％多聚甲醛固定液(3)BouinS液及改良BouinS液(4)ZenkerS液(5)ZamboniS液(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸25ml。(8)KanovskyS液(9)Methacarn固定液，对

4、核内抗原的保存效果较好。(10)PEG液(11)0.4%对苯醌(12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液(13)丙酮及醇类固定剂固定时间：固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15

5、min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min（肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。组织石蜡包埋切片载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。切片粘合剂的使用：（1）多聚赖氨酸（分子量300K

6、D）：0.5%浓度。（2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）干净载玻片→丙酮5min→用镊子夹住浸入APES试剂（1ml+50ml丙酮）1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。（3）铬矾明胶液：铬矾0.5g明胶5gH2O21000ml（4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml明胶0.5gH2O2100ml切片：石蜡切片：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)52－60℃烤片18h。(3)切片厚2～4μm。(4)切片刀要快(5)编上号(6)切片可在4℃保存数年冰冻

7、切片：(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理24h，冰冻切片。(2)冰冻切片后需凉干后立即固定(3)冰冻切片固定后-80℃保存备用细胞爬片制作将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。待细胞生长达到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上。可加甘油封存置于零下20度保存。细胞涂片制作离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，

8、固定2－4小时。在细胞上加一层甘油放-20℃保存。免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学荧光标记免疫组织化学直接法间接法酶联免疫组织化学ABC法S-P法免疫组化二步法二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯PBS冲洗3次，每次3分钟根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性PBS冲洗、浸泡5分钟，3次正常山羊血清室温封闭10分钟甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜PB