免疫组织化学检验技术.ppt

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1、免疫学检验第二十二章免疫组织化学检验技术免疫组织化学检验技术又称免疫细胞化学检验技术---是利用标记的特异性抗体（或抗原）与组织细胞内抗原（或抗体）进行的抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对组织和细胞抗原进行定性、定位、定量测定的免疫检测方法。免疫组化的检测原理免疫组化的检测原理免疫组化的检测原理第一节免疫组化检验技术基本知识免疫组化全过程一、标本制作标本制作是获得良好的免疫细胞组织化学分析的保障，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确显示和定位。（一）标本的主要来源主要有：①活体组织②各种体液及穿刺液③培养细胞等（二）标本的固定与保存1．组织材料的固定目

2、的①防止组织细胞的死后变化，以保持其固有形态②使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构③使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，以便染色后易于鉴别和观察④固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，便于制片⑤防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构⑥经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。2．固定剂的选择最佳固定剂的标准①最好地保持细胞和组织的形态结构②最大限度地保存抗原的免疫活性3．固定方法固定方法常用①浸泡法—主要适用于活检和手术标本以及其它不能进行灌注的组织固定。②灌注法—适用于动物实验研究。（三）玻片的处理

3、玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤之一一般用免疫组织化学的载玻片均需涂一定的黏合剂，常用的切片黏合剂有树脂胶、多聚赖氨酸和防脱片剂（四）切片方法的选择二、抗原处理（一）进行抗原的暴露和修复的原因1.固定液的影响2.抗体制备的影响（二）抗原的暴露主要采用酶消化的方法在选择酶消化时，应针对要显示的不同的抗原成分而选用不同的酶在日常工作中用胰蛋白酶消化即可（三）热诱导的抗原修复抗原修复是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复以提高抗原抗体的阳性检出率微波处理法水浴锅法压力锅法三、抗体处理抗体是免疫组织化学技术的首要试剂（一）抗体的选择具有高度特异性和稳定性的优

4、质抗体（二）抗体的稀释抗原抗体反应须有适当的比例，过量或不足均不能达到预期结果（三）抗体的合理保存要特别注意保持抗体的生物活性四、常用标记物（一）荧光素如：异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明等（二）酶如：辣根过氧化物酶(HRP)（三）生物素-亲和素系统（四）免疫金标记技术（五）免疫铁蛋白技术五、免疫组织化学技术的结果判断（一）对照染色设计为了保证免疫组织化学染色的准确性，证明和肯定阳性结果的特异性，排除某些非特异性染色，通常需针对第一抗体设立对照。1.阳性对照用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组织化学染色。目的是证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可

5、能。2.阴性对照用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。目的是排除假阳性。3.阴性试剂对照是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂（尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性）而设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。4.自身对照是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。（二）阳性结果阳性细胞的显色可位于细胞膜、细胞质和细胞核免疫显色强度和阳性细胞密度是定性、定量指标阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞质(浆)型等）及组织分布特点（如局灶型、弥漫型、片块型等）主要是定位指标哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在

6、部位）也应视为阳性表达（三）阴性结果阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色方法灵敏度有高低之分，有时可因灵敏度不够，而导致阴性反应。（四）特异性显色和非特异性显色的鉴别1.分布位置特异性反应必须分布于特定抗原部位非特异性反应无一定的分布规律2.显色强度特异性反应由于细胞内抗原含量不同，显色强度不一。阳性细胞的染色常定位于细胞，并与阴性细胞间有明显间隔而非特异性染色常不限于单个细胞，常为成片的细胞3.其他在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色六、质量控制质量控制是免疫组织化学检验技术取得满意结果的必要条件。（一）试剂质量控制抗体的质量是免疫组织化学染色

7、成功的关键（二）操作过程质量控制实验操作标本的质量控制（三）仪器设备和器具的质量控制第二节酶免组织化学检验技术酶免组织化学检验技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，然后加入酶的底物，催化底物显色，借助光镜或电镜，就可识别出标本中抗原（抗体）的分布和性质；也可通过图像分析技术达到定量的目的。一、标本制作常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片酶免组织化学检验技术可分为酶标记抗体免疫组织化学染色法非标记抗体酶免疫组织化学染色法二、酶标记抗体的免疫组化染色法（一）原理酶标记抗体的免疫组织化学染色法是借助交联剂的共价键作用将

8、酶直接连接在抗体（或抗抗