gsthdaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定

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1、GSThDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定【摘要】目的构建GSThDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GSThDaxx融合蛋白，并研究其与p53的结合能力。方法构建GSThDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。表达产物用亲和层析柱加以纯化后，Westernblot鉴定表达产物与纯化物。通过共免疫沉淀反应与Westernblot观察hDaxx与p53的结合反应。结果在原核细胞中成功表达了GSThDaxx融合蛋白，hDaxx与p53可发生共免疫沉淀反应。结论1.GS

2、ThDaxx融合蛋白成功表达;2.hDaxx和p53的相互结合提示它们可能与肿瘤的发生有关。【关键词】GSThDaxx融合蛋白p53IdentificationofGSThDaxxProteinConstructionandItsProkaryoticExpressionProductsTANGXuhong,ZHUCuiming,WANYanpingDepartmentofDiagnosisofWesternMedicine,HunanChineseMedicalCollege,Changsha410007,China；InstituteofPathogenicbi

3、ology,NanhuaUniversityAbstract：ObjectiveToconstructarecombinantproteinofGSThDaxxandtoinducetheexpressionofitsfusionprotein.MethodsByconstructingpGEX4T/hDaxxrecombinant,GSThDaxxfusionproteinwasinducedtoexpressbyIPTGinE.coliBL21,andpurifiedbyglutathioneresin.hDaxxfusionproteinwasanalyzedby

4、Westernblot.ThedirectbindingofhDaxxandp53wasstudiedbycoimmunoprecipitationreaction.ResultshDaxxfusionproteinwasinducedtoexpressbyIPTGinE.colisuccessfully.SolubleGSThDaxxfusionproteinwaspurifiedandidentifiedbyWesternblot.ThebindingreactionofhDaxxandp53wasobservedbycoimmunoprecipitationreact

5、ionandWesternblot.ConclusionGSThDaxxfusionproteinwasexpressedandpurified.ThebindingofhDaxxandp53suggestedthattheymayplayimportantroleintumorigenesis.Keywords：GST;hDaxx;fusionprotein;p530引言hDaxx是细胞核内的一种新型转录调控蛋白，它与Fas死亡结构域（deathdomain,DD）相互作用诱导细胞凋亡［1］。hDaxx蛋白定位6p21.3，即位于主要组织相容性复合体(themajorhi

6、stocompatibilitycomplex,MHC),可能与自身免疫性疾病和癌症的发病机理存在着一定的关系［2］。p53是细胞DNA损伤应答过程中的主要成分，它在细胞周期控制、DNA修复、细胞凋亡、细胞分化及血管生成中起关键调控作用［3］。hDaxx可能与p53在病毒感染及细胞凋亡和细胞转化中有重要生物学作用。本文用谷胱甘肽S转移酶（GST）与hDaxx融合蛋白表达载体，在E.coliBL21中成功地用IPTG诱导表达了GSThDaxx融合蛋白，并用亲和层析柱加以纯化，利用Westernblot分析纯化产物及其与p53发生共免疫沉淀反应后的反应产物，以便为在体内外研究h

7、Daxx与p53相互作用及作用效果提供前期实验依据。1材料与方法1.1主要仪器与试剂电穿孔机及低温超速离心机分别系BIO-RAD公司与Beckman公司产品，操作按说明书进行。限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶购于BechringerMannheim公司。IPTG购于FisherScientific公司，还原型谷胱甘肽、DEAEsephacel、glutathionsepharase4B购于Pharmacia公司，ECL试剂购于MENTM公司。兔抗Daxx抗体(αDaxx)、兔抗GST抗体