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1、XX大学毕业论文Snail/GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备2014年6月25日Snail/GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备作者：张儒英，云昆仑，乔惠珍，王冰晶，张志谦【关键词】Snail；融合蛋口；多克隆抗体0引言上皮型钙粘附素（Ecadherin,Ecad）介导的粘附系统的破坏，是肿瘤从非浸润性转化为浸润性的关键步骤［1］。而锌指转录因子Snail,具有下调Ecad的作用［2］,本研究通过制备Snail抗体，为进一步开展Ecad的功能研究和应用奠定了基础。1材料和方法1.1主要试剂和菌株主耍试剂购自北京中山公司；大肠杆菌DH5a
2、和BL21由北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所细胞实验室保存。1.2pGEX4T1/Snail原核表达载体的克隆从人血管内皮细胞捉取总RNA,在逆转录酶作用下，合成cDNAo以逆转录的cDNA为模板，用上游引物亍CTGCAGGACTCTAATCCAG3，（含有EcoRI内切酶位点）和下游引物5，ATCCTTGGCCTCAGAGAGC3,（含冇SalI内切酶位点），进行PCR扩增，得到SnailC末端377bp的DNA片断；嗨切、琼脂糖凝胶电泳分离后，用玻璃奶法（自制）纯化冋收，与pGEX4T1原核表达载体定向连接。转化DH5（x感受态细菌，捉取质
3、粒并酶切鉴定重组体。1.3融合蛋口的诱导表达与纯化1.3.1表达鉴定表达质粒Snail/pGEX4T1转化大肠杆菌DH5a后,经过酶切鉴定，挑取阳性细菌克隆至3mlLB/Amp+试管中培养3〜5h。SDSPAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。1.3.2可溶性鉴定离心诱导菌液，收集菌体，以PBS重悬（50nlPBS/lml菌液），加细菌裂解液混匀，冰浴。加入TritonX100至终浓度为1%,冰浴。冰上以20Hz间歇超声裂解。再离心并分别收集上清和沉淀，进行SDSPAGE,证实融合蛋白以包涵体形式存在。1.3.3纯化加5倍体积超声缓冲液悬浮沉淀，冰上间歇超
4、声30s,离心弃上清。重复3〜4次。沉淀加等体积SDSPAGEloadingbuffer,超声重悬，沸水煮5min后上样，100V电泳6〜7h。用冷0.1MKC1浸泡胶，切下目的条带放入透析袋内。将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V洗脱过夜，次H100V继续洗脱lh,然后反转电极向相反方向洗脱3〜5min。吸出透析带内液体，蔗糖包埋浓缩，PBS透析。行SDSPAGE定量，即获得纯化的融合蛋白。1.4抗Snail多克隆抗体的制备抗原为原核表达并经SDSPAGE胶纯化的GST/Snail融合蛋白，免疫新四兰白兔。取耳血，用ELISA法测定抗体效价,当效价
5、达到10・5时，放血，收集血清。1.5抗体效价和特异性免疫学鉴定1.5.1酶联免疫吸附实验（ELISA）检测抗体滴度：观察结果并用ELISAReader测OD490nm。1.5.2WesternBlot鉴定抗体SDSPAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。2结果2.1Snail/pGEX4T1原核表达载体的构建和鉴定结果以Snail全长为模板，PCR大量扩增出Snail片段，经鉴定在约400bp处有条带扩出，与推算值相符；将目的片段装入pGEX4T1原核表达载体后，酶切鉴定正确，在近400bp处有条带释放。2.2融合蛋白GST/Snail的诱导表达和纯化经
6、纯化的GST/Snail融合蛋口只有一条蛋口带。2.3Snail多克隆抗体活性鉴定231ELISA鉴定经制备型SDSPAGE进一步纯化的融合蛋白GST/Snail免疫新西兰兔获得抗血清，ELISA实验结果表明，其效价为5x105。2.3.2WesternBlot鉴定抗体Snail/pGEX4T1感染的细胞在近40KD处出现条带。3讨论木课题通过基因工程手段原核表达Snail竣基端的GST融合蛋白[3],然后免疫新西兰兔获得效价高、特异性强的抗Snail抗体，与一些进口抗体相比造价低，且适用于免疫荧光、石蜡切片等[4],为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾
7、病的相关性提供了工具。我们利用该抗体研究了宫颈不同组织学阶段的蜡块标本，Snail1表达的免疫组织化学反应在宫颈癌屮呈上升趋势，阳性表达率为81.9%,与正常及非典型增生组羌别明显（PV0.05）,证明Snail与癌分化程度相关。表明了Snail是肿瘤进展过程中浸润的一个重要的调节因索[5],为今后进一步揭示肿瘤的浸润和转移开创了新的途径和工具。【参考文献】[1]CanoA,PerezMorenoMA,etaLThetranscriptionfactorsnailcontrolsepithelialmesenchymaltransitionsbyrep
8、ressingEcadherinexpression[J]•NatCellBiol,2000,
