t载使用中常见问题

《t载使用中常见问题》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、T栽使用说明Q-1：TA克隆的原理?大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都会在PCR产物的3′末端添加一个“A”，T载体是3′带有一个“T”的载体，在连接酶作用下，完成连接，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。TA克隆的原理请见下图：Q-2：蓝白斑筛选的原理?蓝白斑筛选原理是：载体上携带一段细菌的lacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽，载体转化的受体菌为lacZ△M15基因型。这样，载体同宿主通过互补，具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基因中插入外源DNA，造成lac

2、Z基因缺失，不能合成α-肽，失去同宿主的互补，不能形成有功能的β-半乳糖苷酶，失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上，含阳性重组体的细菌为白色菌落（质粒载体）或无色噬菌斑（M13噬菌体载体）；非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。Q-3：Takara有哪些常用的PCR产物克隆用T载体，各有什么特点?常用的PCR产物克隆用T载体及各自的特点请见下表：CodeNo.产品特点应用3275pBackZero-TVectorCloningKit由pUC19改建，阳性克隆率极高而背景极低。它消除了pUC19载体上的lacZ基因及

3、多克隆位点，并对β-lactamase(bla)基因进行了独特的改造，可以定向克隆。使用时需在待插入的DNA片段的上、下游Primer的5′端加上TTTAA5个碱基。如果需要进行定向克隆，只需在一条引物的5′端加上TTTAA5个碱基。PCR产物3′端有“A”，TA克隆。6011pMD™18-TVectorCloningKit由pUC18构建，含有多克隆位点，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。PCR产物3′端有“A”，TA克隆。6013pMD™19-TVectorCloningKit由pUC19构建，含有多克隆位点，可以进行蓝白筛

4、选，无方向性克隆。PCR产物3′端有“A”，TA克隆。3271T-VectorpMD™19(Simple)由pUC19构建，不含有多克隆位点，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。PCR产物3′端有“A”，TA克隆。根据实验需要，可以在引物的5＇端导入酶切位点。6012pSIMPLE-19 EcoRV/BAPVector由pUC19构建，不含有多克隆位点，是种平末端去磷酸化载体，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。与5′端磷酸化的平末端PCR产物进行连接。3270T-VectorpMD™20由pUC19构建，含有多克隆位点；并对lacZ

5、基因进行改造，降低假阳性，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。PCR产物3′端有“A”，TA克隆；含有SP6Promoter，可以对插入的DNA进行体外转录。Q-4：pMD19-TVector与pMD18-TVector相比，有何不同?pMD19-TVector与pMD18-TVector相比，β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。pMD18-TVector连接转化后，一般要经37℃过夜培养，然后再将其于冰箱内放置一段时间后，其蓝白菌落才能显色。而pMD19-TT栽使用说明Vector涂板培养后

6、一般只需10个小时（37℃）便可以显色。因此，pMD19-TVector比pMD18-TVector更适合于蓝白菌落的筛选。Q-5：使用Takara的T载体，对感受态细胞有什么要求?转化时请使用高效的感受态细胞（转化效率≥1×108 cfu/μgpUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F′编码的［lacZ△M15］）产生ωFragment，才可能和载体DNA产生的lacZα多肽相结合，表现出β-半乳糖苷酶活性（α-互补性），才可以进行蓝白筛选。通常使用的JM109，

7、DH5α等细胞均可进行蓝白筛选。Q-6：使用Takara的T载体，对InsertDNA有什么要求?使用Takara克隆用T载体，对InsertDNA有以下的要求：1．InsertDNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用Takara凝胶回收试剂盒（CodeNo.9762）。2．InsertDNA的使用量及计算方法。进行克隆时，VectorDNA和InsertDNA的摩尔数比一般为1：3～10，可以根据具体的实验情况选择合适的VectorDNA和InsertDNA的摩尔数比。

8、InsertDNA使用量的计算方法如下：InsertDNA的使用量（ng）=nmol数×660×InsertDNA的bp数Takara的T载体1μl（50ng）的摩尔数约为0.03pmol。Q-7：如何计算感受态细胞的转化效率?取0.1ng的pUC19PlasmidDNA加入