肌肌酸激酶mb同功酶的克隆及原核表达

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1、人心肌肌酸激酶MB同功酶的克隆及原核表达李子颖作者单位：原子高科股份有限公司（北京102413）；2中国食品药品检定研究院（北京100050）；3中国原子能科学研究院通讯作者：李子颖，E-mail：ciaelee@yahoo.com.cn，贾娟娟2，刘一兵1，韩世泉3【摘要】目的构建人肌酸激酶MB同工酶的原核表达系统，纯化重组酶蛋白并检测其活性。方法从购买的含CKM、CKB基因片段的质粒中扩增人肌酸激酶M、B亚基基因，构建pGEX-4T-1-CKMBE．coliBL21(DE3)GST原核表达系统。以异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋

2、白表达。利用重组蛋白的GST标签亲和层析纯化。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期相符，诱导表达后细菌裂解液纯化后SDS—PAGE在分子量110,000（CKMB）处显示单一蛋白条带，采用酶联免疫分析的方法进行免疫活性实验，所得的蛋白和CKB、CKM抗体都有免疫结合。结论成功表达并纯化了人肌酸激酶MB同工酶。【关键词】：人肌酸激酶MB同工酶；原核细胞；基因表达Cloningandprokaryoticexpressionofhumncreatinekinase-MBisoenzyme(CK-MB)LiZi-ying*,JiaJuan-juan,

3、LiuYi-bing,HanShi-quan（*AtomHighTechCo.,Ltd.，Beijing，102413，China）【Abstract】ObjectiveToclonethewholegeneofhumancreatinekinaseMBisoenzyme(CK-MB)andexpressinprokaryoticcells,thenpurifyrecombinantCK-MBanddetermineitsantigen-bindingactivity.MethodsTheCKM、CKBgenewereamplifiedfrompla

4、smidweboughtandinsertintoprokaryoticexpressionvectorpGEX-4T-1withGSTtag.TheconstructrecombinantplasmidpGEX-4T-1-CKMBwastransformedtoEcoli.BL21(DE3)forexpressionunderinductionofIPTG.TheexpressedfusionproteinwaspurifiedbyGSTchromatography,thendeterminedantigen-bindingactivitybyEL

5、ISA.ResultsPCR、restrictionanalysisandsequencingprovedthatrecombinantpGEX-4T-1-CKMBwasconstructedcorrectly.Theexpressedrecombinantfusionproteinwithrelativemolecularmass110000showedspecificbindingtopolicolonalantibodyagainstCKMandCKB.ConclutionTheCK-MBwassuccessfullyexpressedinpr

6、okaryoticcellsandpurified.[Keywords]Humncreatinekinase-MBisoenzyme；Prokaryoticcells；Geneexpression急性心肌梗死(acutemyocardialinfarctionAMI)患者存活率的关键是早期快速诊断，因为心肌细胞在梗死6h后通常不可逆转。对于诊断急性心肌梗死(AMI)，目前心肌标志物中的肌酸激酶(creatinekinaseMB，CK-MB)质量被视为诊断急性心肌梗死较敏感的指标之一[1]。肌酸激酶同工酶CK-MB主要存在于心肌细胞中。急性心肌梗死(A

7、MI)时心肌细胞受损，膜的完整性和通透性改变，使细胞内的大分子逸出，能在外周血中被检测到。这些大分子物质被称为心肌损伤标志物。在这些心肌标志物中CK-MB是升高较早，上升幅度较大的一种酶，也是迄今为止诊断AMI最佳且临床上应用最广泛的血清酶指标之一。AMI后CK-MB于4h升高，16～24h达高峰，48～72h恢复正常，其升高程度能较准确地反映梗死的范围，其高峰出现时间是否提前有助于判断溶栓治疗是否成功[2-4]。目前CK-MB质量的检测是采用免疫分析的方法，需要使用大量高质量的标准品和抗体[5-7]。由于人CK-MB天然来源的有限性，通过基因工程重

8、组CK-MB来制备高质量免疫原和标准品成为重要的途径[8-11]。1、材料与方法1．1质粒、菌株及细胞原核表