考马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量

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1、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量专业班级：制药工程3班小组成员：李梦娴李敏林晓丝一、实验目的1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤二、实验原理1、根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250是比色法与色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内，也就是蛋白质含量在0~1000ug范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。2、考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。三、仪器与试剂1、仪器：分析天平

2、；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100ml×2、50ml×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。2、试剂：（1）蒸馏水。（2）标准蛋白质溶液：用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液。（3）考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于5ml90%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸10ml,最后用蒸馏水定容至100ml（此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月）；将定容好的染液过滤并装入棕

3、色瓶中保存。（4）样品液：用移液枪取1ml纯牛奶液体（经调查，市场上大部分纯牛奶中蛋白质的含量大致为每100ml中2.5~3.5g），用蒸馏水稍做稀释，然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用10ml的吸量管吸取10ml一号容量瓶中的液体于二号100ml的容量瓶中，最后用蒸馏水定容至100ml，此时二号容量瓶中为待测样品液。三、操作步骤1、0~100μg/ml标准曲线的制作：取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出

4、标准曲线。管号12345678蛋白质标准液（ml）00.10.20.30.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.90.80.70.60.40.20考马斯亮蓝染液55555555蛋白质含量（μg）0102030406080100A59500.3030.4170.4620.5490.6220.8040.9062、样品中蛋白质含量测定另取两支干净的试管（做一重复），标号A、B。分别加入1ml待测样品液体和5ml考马斯亮蓝染液，将两支试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。标号AB待测样品液体(ml)11考马斯亮蓝染液(m

5、l)55A5950.4510.463蛋白质含量（μg）五、数据处理1、将测得的吸光度填入上表中，并根据数值作出标准曲线。2、计算公式：样品中的蛋白质含量（μg/g鲜重）={[查得的蛋白质含量（μg）]×稀释倍数}/[样品鲜重（g）]六、注意事项1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。2、测定中，蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。3、若选择在漩涡器上混合，注意不要太剧烈，以免产

6、生大量气泡而难以消除。五、思考与讨论1、制作标准曲线及测定样品时，为什么要将个试管中溶液纵向倒转混合？答：因为可以使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有很大的偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。2、列举几种常用的蛋白质定量测定的方法，并于考马斯亮蓝染色法相比较各有何优缺点。答：1.目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。2.考马斯亮兰法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变

7、化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定