考马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量

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1、实验十四考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。二、原理考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是19

2、76年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。二、材料、主要仪器和试剂1．实验材料新鲜绿豆芽2．主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3．试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液。（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-

3、250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。（3）乙醇（4）磷酸（85％）四、操作步骤1．标准曲线制作（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。表1低浓度标准曲线制作管号1234561000μg／mL标准蛋白液（mL）00.020.040.

4、060.080.10蒸馏水（mL）1.000.980.960.940.920.90考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555蛋白质含量（μg）020406080100OD595nm      （2）0~1000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1000μg／mL的标准曲线。表2高浓度标准曲线制作管号7891011121000μg／mL标准蛋白液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.000.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555蛋白

5、质含量（μg）02004006008001000OD595nm      2．样品提取液中蛋白质浓度的测定（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混

6、合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1号试管做空白。表3待测液蛋白质浓度测定管号1314蛋白质待测样品提取液（mL）0.10.95  0.10.95  蒸馏水（mL）考马斯亮蓝G-250试剂（mL）OD595nm蛋白质含量（μg）五、结果计算 X×提取液总体积（mL）样品蛋白质含量（μg/g鲜重）=测定时取样体积（mL）样品鲜重（g）式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。六、附注1．Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物

7、质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。2．有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。3．蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。七、思考题1．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？参考答案1．将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲

8、线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。