生物化学基本实验技术

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1、Ⅰ生物化学基本实验技术一、分光光度法（一）原理光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400—760nm。短于400nm的光线称为紫外线（200—400nm为紫外光区），短于200nm的叫远紫外线，再短的就是X射线和γ射线了。长于760nm的光线称为红外线（760—500000nm为红外区），再长的就是无线电波了。可见光区的电磁波，因波长不同而呈现不同的颜色，这些不同颜色的电磁波称为单色光，单色光并非单一波长的光，而是一定波长范围内的光，太阳及钨丝灯发出的白光，是各种单色光的混合光，利用棱镜可将白光分成按波长顺序排列的各种单色

2、光，即红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等，这就是光谱。当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过，因此光线射出溶液之后，部分光波减少。例如，可见光通过有色溶液后，或红外线通过多种气体后，部分光波被吸收。不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比，故可利用各种物质的不同的吸收光谱特征及其强度对不同物质进行定性和定量的分析。在可见光范围内，利用溶液的颜色深浅来测定溶液中物质含量的方法，称为比色法。采用适当的光源、棱镜和适当的光源接受器，可使溶质浓度的测定范

3、围不仅仅局限于可见光，尚可扩大到紫外光区和红外光区。这就是分光光度法。分光光度法是生物化学中最有价值的测定方法之一。通过测定紫外、可见或红外的特征吸收光谱可以鉴定未知化合物；通过测量在某一波长的光吸收可以测定溶液中未知化合物的浓度。分光光度法所依据的原理是Lambert和Beer定律。1．Lambert定律一束单色光通过透明溶液时，一部分波长的光波被吸收，被吸收光波的量与溶液厚度有一定的比例关系。即：18I=I0e-al..............................（1）式中I0为入射光强度I为通过溶液后的光强度l为溶液的厚度e为自然对数的底2.71

4、8a为溶液的吸光率（1）式可改写为：lnI0/I=al...........................（2）将（2）式换算成常用对数式，即：lgI0/I=0.4343.al令k=0.4343.a则lgI0/I=kl............................（3）此处以k为吸光率。1．Beer定律以溶液中溶质浓度变化代替溶液厚度的改变，光波的吸收与溶质浓度的改变有类同的关系。即一束单色光通过溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质浓度有一定比例关系。依据Lambert定律中同样的推导，可得出下式：lgI0/I=kc...........

5、.................（4）式中c为溶液中溶质的浓度。Lambert定律和Beer定律合并，即（3）和（4）式合并为（5）式：18则A=kcl.................................................（6）A=-lgT式中A为吸光度（光密度、消光度），T为透光度。其中k为常数，又称为消光系数（extinctioncoefficient），表示物质对光线吸收的本领，其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。（6）式为Lambert-Beer定律的物理表示式，其含义为：一束单色光通过

6、透明溶液后，光波被吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液的厚度成正比。此式为分光光度法的基本计算式。（二）计算利用分光光度法对物质进行定量测定的方法，主要有以下三种：1．利用标准管计算测定物含量（直接比较法）实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读取吸光度，再根据（6）式计算，即2．利用标准曲线换算（标准曲线法）先配制一系列已知浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，读取各管光密度。然后以各管光密度为纵轴，浓度为横轴，在坐标纸上作图得标准曲线。再以测定管光密度从标准曲线上查得测定物的浓度。标准曲线的制作与测定管的测定，应在同一仪器上进

7、行，在配制样品时，一般选择其浓度相当于标准曲线中部的浓度较好。3．吸收系数法利用克分子消光系数ε求取测定物浓度。当溶液浓度c为181mol/L，溶液厚度l为1cm时的消光系数既为克分子消光系数，以ε表示，此时ε与A相等。实际应用中测定物常以g/ml作浓度单位。ε值在λmax时，可在一定实验条件下测得或由手册药典中查出。在已知ε的的情况下，可将样品在同样条件下测定其A值，再根据下式求得样品的浓度。C=A/ε（三）分光光度计的结构分光光度计的种类很多，其基本原理及结构基本相似，一般都包括下列几个部件，如下图所示。1．光源一个良好的光源要求具备发光强度高，光亮，稳定，光

8、谱范围较宽