生物化学实验基本技术解读课件.ppt

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1、生物化学实验基本技术第一节生物大分子的基本制备技术一、盐析（Salting–out）技术定义：蛋白质在高浓度盐的溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。影响因素：1.盐的种类2.盐的浓度3.pH值4.温度5.蛋白质浓度二、透析和超滤(DialysisandUltrafiltration)1.透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜而进行纯化的一种方法。2.超滤是利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，对生物大

2、分子溶液进行过滤（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。第二节分光光度法一、基本原理当一束白光通过一杯有颜色的溶液时，具有一定波长的光线选择性的被溶液所吸收。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度。其理论依据是郎伯—比尔(Lambert-Beer)定律。A=KCL二、分光光度计的结构原理三、几种

3、常用的国产分光光度计（一）721型分光光度计（二）UV-754型分光光度计是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。第三节层析技术原理层析技术分类名称操作方式固定相流动相分离依据分配层析纸层析薄层层析液体液体溶解度离子交换层析离子交换柱层析固体液体带电性静电引力吸附层析吸附薄层层析气体吸附层析固体固体液体气体吸附力亲合层析酶与底物抗原与

4、抗体固体液体配体专一性凝胶层析凝胶过滤固体液体分子大小常用的层析原理1.分配层析——纸层析原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（α）。固定相内溶质的浓度流动相内溶质的浓度固定相：滤纸上吸附的水流动相：有机溶剂（酚）α=纸层析纸层析是最简单的液一液相分配层析。滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，R

5、f是个常数。2离子交换层析原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基可交换离子：阳离子：Na+、H+阴离子：Cl-、OH-示意图（交换树脂表面）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子示意图水分子B物质A物质3吸附层析原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停

6、留一定时间然后才离开，此为吸附现象。吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。在不同条件下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。吸附层析示意图吸附剂易吸附分子不易吸附分子4亲和层析原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物

7、。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。5凝胶过滤原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。第四节电泳技术一、定义：在溶液中，带电粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动的现象，称为电泳。二、电泳技术分类三、电泳技术基本

8、原理1.基本原理不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。pH>pI分子带负电荷,在电场中向正极移动;pH