高分辨率熔解曲线分析技术用于乙醇脱氢酶b和乙醛脱氢酶基因的快速分型（可编辑）

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1、高分辨率熔解曲线分析技术用于乙醇脱氢酶1B和乙醛脱氢酶2基因的快速分型南方医科大学级硕士学位论文高分辨率熔解曲线分析技术用于乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因的快速分型?课题来源:十一五国家支撑计划课题.和国家高技术研究发展计划计划,.业称专名医学遗传学学位申请人袁晓文指导教师徐湘民教授周万军博士’龚瑶琴教授答辩委员会主席邬玲仟教授答辩委员会成员王红艳教授袁慧军教授赵彦艳教授论文评阅人白晓春教授孙筱放教授日年月深圳高分辨率熔解曲线分析技术用于乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因的快速分型硕士研究生:袁晓文导师:徐湘民教授摘要背景与目的乙醇脱氢酶,和乙醛脱氢酶,是在人体内乙醇代谢途径

2、的两个关键酶,负责催化人体的乙醇分解代谢,即催化乙醇向乙醛转化以及乙醛向乙酸盐分解的关键酶。的活性增强可以加速乙醇向乙醛转化,而活性的降低则使乙醛向乙酸盐转化受到限制,同样使乙醛的浓度显著增高。乙醛浓度的增加与酒精相关性疾病的发生发展有一定关系。和基因多态性具有种族特异性,在不同种族人群中分布是不一样的。据研究显示,亚洲人的酒精依赖性疾病主要与和基因变异密切相关。基因位于号染色体长臂区带,基因在第号外显子发生变异,形成,导致亚基的第位氨基酸从精氨酸转换为组氨酸从而形成艮,酶活性增高。基因位于号染色体长臂区带,基因在第号外显子发生变异,形成,与此同时,酶的第位氨基酸

3、由谷氨酸变为赖氨酸。野生型具有活性,突变型没有酶活性。和基因的变异会使酶代谢活性改变,导致饮酒在不同种族和个体间酒精代谢发生改变。这些年来,研究发现这两种变异与摘要各个组织器官的癌变,乙醇相关的肝脏病变、迟发型老人痴呆、冠心病、型糖尿病并发症、血液中胆固醇水平都有不同程度的联系。因此,一种准确快速的基因型分析方法对于有关的临床研究和人群普查等广阔研究领域是十分必要的。近年发展起来的高分辨率熔解曲线分析,技术已被证明是一种具有低成本、高通量、速度快、操作简便、高灵敏度等优点的用于基因突变检测、基因分型和检测的工具。不同核酸分子的片段长短、碱基组成、分布等是不同的,因

4、此在加热变性后所有的双链分子都会有自己相应的熔解曲线形状和位置。当扩增目的片段含有突变/时,目的产物经过变性.复性会产生异源双链,异源双链中突变/位点是不匹配的,所以双链在升温过程中先解链,此时荧光染料从局部解链的双链分子上释放出来,根据荧光强度与温度曲线图可以判断是否具有突变/,同时不同的位点和杂合度都会影响熔解曲线的峰形。分析过程中,随着双链分子的扩增,由于荧光染料结合到重新产生的双链分子,荧光信号不断的增强。当进入扩增平台期时,荧光信号同时也进入了平台期。随着温度的不断升高,双链逐渐解开,结合上的饱和染料被释放出来,荧光信号逐渐减弱。直到温度升到℃,所有的双

5、链分子完全解开,通过检测荧光值,建立荧光值随温度升高的变化过程得到熔解曲线。技术的基本原理就是根据熔解曲线的差异性来对样品进行区分。以往的变异检测技术,限制性内切酶片段长度多态性,,单链构象多态性分析,,两对交叉引物、Ⅳ.,,扩增产物长度多态性,变性高效液相色谱等具有一定的局限性,如耗时长,操作繁琐,准确度低,成本相对较高等。与这些方法相比,分析方法具有一定的优势:成本低,只需饱和染料不需要昂贵的探针;在反应结束后,不需要后续工作而Ⅱ硕士学位论文直接进行熔解曲线反应;快速、高通量,一次可以同时检测或个样本;闭管操,防止样本遭受污染;经过分析处理后的扩增产物还可以直

6、接进行测序,十分方便快捷。具有较高的敏感性和特异性,目前已广泛应用于生命科学、医学、农学、畜牧业等各个领域的研究工作中。基于上述特点,本研究拟应用技术,建立和的检测方法,对预测个体患酒精相关疾病的风险和研究酶变异与酒精相关疾病的关系提供方便,同时为中国南方酒精相关疾病患者的遗传咨询、临床诊断提供有用的信息。材料与方法.标本:共收集例全血标本。采用标准的饱和酚/氯仿法提取外周血中的基因组。.分子分析方法:针对和基因以及和变异位点设计扩增体系及优化条件。通过测序获得和各种基因型样品。建立检测和基因的高分辨率熔解曲线分析技术。针对和基因以及和变异位点设计分析的引物,利用

7、经测序已知的基因型样品优化分析条件,从而建立和基因的高分辨率熔解曲线分型的分析方法。根据的分析结果,从各种基因型中选取一定数量的样品进行测序分析,以验证评价该方法的准确性。并且选取每种和基因野生纯合子和突变纯合子各个样本进行重复实验。同时对基因的野生纯合子和突变纯合子样本进行了倍稀释法,进行个浓度检测,探讨该方法检测敏感性。.统计学分析:对构建的和基因已知突变分型检测体系进行准确性和稳定性分析。利用部分样本直接测序对比来验证其准确性;采用重复性实验以确定该体系的稳定性与准确性。同时分析东莞地区随机汉族人群的摘要和的基因频率和基因型频率,并应用矛检验该群体样品是否符

8、合?平衡。