总rna的提取和rt-pcr

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1、实验总RNA的提取、定量与RT-PCR南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心http://jpkc.fimmu.com/sfzx/完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。掌握从细胞中提取总RNA的方法熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法掌握RT-PCR基因扩增的原理和操作方法目的http://jpkc.fimmu.com/sfzx/实验流程提取原理操作步骤逆转录原理操作步骤提取总RNA定量合成cDNA第一链原理体系引物选择PC

2、R电泳原理电泳步骤电泳计算方法操作步骤第一部分细胞总RNA的提取及定量原理10-5mgRNA/细胞mRNA3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。rRNA80-85%：28S18S5StRNA,snRNA10-15%mRNA1-5%原理：Trizol的主要成分Trizol是一种新型总RNA抽提试剂主要成分是异硫氰酸胍和酚

3、。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。原理所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；有效地将ＲＮＡ从

4、ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。关键点RNA酶污染来源RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。防止RNA酶污染的措施所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。有机玻璃的电泳槽等，可

5、先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。操作步骤1.匀浆化作用悬浮细胞连同培养液8000离心2min,弃上清；加入１ml的ＲＮＡisoPlus,用移液枪反复吹吸直无明显沉淀,室温静置5min.2.分离阶段向匀浆

6、样品中加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温下孵育5min，12000g离心15min，吸取上清至新Ep管。3.RNA的沉淀向上清中加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀,室温孵育10min，12000g离心10min，小心吸取并弃去上清液，可见胶状沉淀。4.RNA的漂洗加1mL75％乙醇洗涤沉淀一次，轻轻上下颠倒洗涤，12000g离心5min,弃去乙醇.5.RNA的再溶解空气干燥RNA沉淀，注意不要完全干燥，加入10uLRNase-Free处理水，充分震荡混匀。原理：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应而且物质对光的吸收是具有选择性的各种不同的物质都具

7、有其各自的吸收光谱因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系.紫外光吸收法紫外吸收检测RNA的浓度RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。用双蒸水稀释RNA样品n倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可

8、以估计RNA的纯度。若OD260/OD280小于2，说明可能有DNA片段污染，可以考虑用无RNase的DNase处理样品，