3. 总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR

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1、实验二、RNA提取及RT-PCR实验内容1、小鼠肝脏组织总RNA的提取2、RNA的琼脂糖凝胶电泳3、以RNA为模板进行RT-PCR4、PCR产物的电泳及回收实验一.提取小鼠肝脏组织的RNA一、真核细胞的总RNA1、mRNA:1-5%5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。1）免受核酸酶破坏，2）起始、促进蛋白质合成。3`poly(A)尾巴结构20--200个A.翻译所必需。起始密码：AUG终止密码：UAA,UAG,UGA。2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大亚基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt小亚基40S:18S=1874nt二、R

2、NA提取的注意事项RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。1、尽量避免外源性RNase污染A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。B.用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）C.一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处理后）高压灭菌。D.玻璃器材、水都应该经过去RNase处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制内源性RNase活性：RNase抑制剂。RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。将1mLTrizol试剂移入Eppendorf管中。2)实验教师操作:取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大

3、,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mLTrizol试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。4)室温孵育10min。三、RNA提取的实验操作播放有声课件1:RNA提取方法及注意事项1、异硫氰酸胍法：GuSCN是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。特点：需低温操作，但价格经济。2、Trizol试剂（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总RNA，简单、快速、提取量大、纯度高。3、mRNA提

4、取试剂盒真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。RNA提取的几种方法室温孵育10min介绍RNase抑制剂1、DEPC(二乙基焦炭酸盐)最常用的RNase抑制剂:与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。有效浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。用于浸泡各种器材。灭活条件：高压。在Tris溶液中半衰期为1.25min。试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制,高压)储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4C，或液氮中。2、肝素：使用浓度：0.1—10mg/ml效果:37C时，可抑制

5、95%的RNase活力。如果与DEPC联合应用，具有极强的抑制效果。5)加入200l氯仿，震荡混匀20-30s，室温放置5min（此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体）。6)10000rpm，离心5minRNA(清澈透明)DNAProtein7)将清澈透明的上层水相转移至另一离心管中。有声课件2:RNA干燥及溶解技巧8)沉淀RNA：加0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温10min。10,000rpm，4C，离心10min．弃上清。９)加1ml75%乙醇洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)10)7500rpm，4C离心1min，弃上清．再离心几秒钟

6、，将管壁液体（用加样器）完全移净。用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。11)室温干燥3－5min（根据RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）注意事项：RNA:避免放在37C孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。RNApellet：透明胶样干燥后应该无色透明12）RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H

7、2O13.5l，加到RNA上，进行吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。13)吸出4.5l溶液放到冰上备用(将用于电泳).14)剩余9l溶液,放到冰上备用（将用于RT－PCR）.注意：RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。避免气泡的方法：用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯为止。实验二.RNA的琼脂糖凝胶电泳基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶