血管性血友病因子裂解蛋白酶活性的检测方法及评估

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1、血管性血友病因子裂解蛋白酶活性的检测方法及评估血管性血友病因子裂解蛋白酶活性的检测方法及评估血管性血友病因子裂解蛋白酶活性的检测方法及评估血管性血友病因子裂解蛋白酶活性的检测方法及评估血管性血友病因子裂解蛋白酶活性的检测方法及评估国外医学输血及血液学分册2005年第28卷第6期血管性血友病因子裂解蛋白酶活性的检测方法及评估刘芳综述王兆钺审校【摘要】血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13,vWF—CP)裂解血浆中具有高黏附能力的超大分子量血管性血友病因子(UL—vWF),防止血小板因其引起聚集形成血栓.ADAMTS13活性异常是临床上血栓性血小板减少性紫癜(TTP),特别是遗传性TTP和特

2、发性TTP发病的基础.其活性的检测在TTP临床诊断和治疗上具有日益重要的意义.目前报道的一些用于检测ADAMTS13活性的方法有十余种,本文对此进行综述.【关键词】血管性血友病因子裂解蛋白酶;血栓性血小板减少性紫癜;yonWillebrand因子;检测ADAMTS13(adisintergrin—likeandmetallo—proteasethrombospondintype1motifrepeats),也被称为vWF—CP,是1996年首次报道的血浆中vWF裂解蛋白酶口].研究表明,血浆中ADAMTS13在一定剪切力的条件下,作用于vWF分子A2区842酪氨酸与843位蛋氨酸之间的肽键

3、,将vWF裂解为不具有黏附活性的两个片断.目前检测ADAMTS13活性的方法正是依据这一机理设计的.无论使用哪种试验手段,最终是通过检测vWF是否被裂解来判断前者的活性.其方法主要有以下几种.1检测vWF多聚物1.1定性法Furlan等使用SepharoseCL一2B凝胶滤柱从人冷沉淀中分离vWF多聚物,经酶联免疫试剂盒测定vWF含量,并将待测的含ADAMTS13酶的血浆在10mmol/L的BaC1溶液中37C温育5min,以达到最大的裂解活性,再将血浆与一定量的vWF多聚物按比例混合,放入含1mol/L尿素(使vWF变性并使其空间结构舒展,暴露酶切位点)pH8.0的Tris—HC1透析液

4、中,37C透析24h.将透析后的液体按Ruggeri和Zimmerman报道的水平十二烷基磺酸钠一琼脂糖凝胶电泳(SDS—PAGE)法在80V,10mA条件下,16C环境中电泳17h.电泳后,使用放射性I标记的vWF多克隆抗体进行放射白显影,或是电转膜后使之与酶标的抗人vWF多抗结合,增强化学发光法显影口].将正常人血浆按比例稀释后作标准曲线,标准曲线中ADAMTS13活性依次设为1:20(活性100),1:40(5O),1:8O(25).1:160(12.5),1:320作者单位:215006,苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所?519??综述?(6.25),1:640(3),缓冲液(

5、0).待测血浆1:20稀释.根据其多聚物电泳情况,判断ADAMTS13活性水平.该方法的缺点是其使用的底物纯化的vWF中有一定的内源性ADAMTS13,目前用该手段检测ADAMTS13活性多使用改良法,即使用商业化的vWF纯品l4],或使用重组vWF],以上两种底物均无内源性ADAMTS13.如使用从正常人混合血浆中获得的vWF则只收集早期的片段(无内源性ADAMTS13),或用丝氨酸蛋白酶抑制物,抑制其内源性ADAMTS13的活性.经典的vWF多聚物电泳操作步骤复杂,耗时较长,不宜应用于临床.其结果的可信性曾遭到Tsai的质疑l6].但在2004年发表的十一种ADAMTS13检测方法评估

6、中,应用该方法检测的结果与预期值一致性高,决定系数(r)达0.94,是目前应用的较为稳定的方法之一[.为将此方法应用于临床,2001年Aronson等口报道使用自身的vVw作底物,直接将血浆在含尿素的缓冲液中透析过夜,再电泳.该方法在一定程度上缩短了检测时间.是我室检测ADAMTS13活性较常用的方法之一.1.2定量法Flowchamber法检测ADAMTS13切害0UL—vWF的能力是目前惟一一种定性检查方法.该法与其他各实验室在静态的基础上完成酶裂解的过程完全不同,可真实模拟体内环境,在一定剪切力的基础上检测ADAMTS13的活性.Flowchamber小室中单层培养的人脐静脉血管内皮

7、细胞在一定条件刺激下生UL—vWF,使用正常人的血浆和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)患者的血浆按一定流速灌注,血浆的流速产生剪切力2.5dyne/cm.,10min之内,正常人血浆中ADAMTS13可以切断UL—vWF,而TTP患者的血浆灌注时则形成UL—vWF黏附在内皮细胞表面,血小板不断黏附在UL—vWF上,形成潜在血栓的状态].该试验方法在评估中结果不理想,在检测预期ADAMTS13活性在20的样本时,仅有不到一