生物荧光肿瘤体外药敏检测技术的临床应用及其探讨

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1、生物荧光肿瘤体外药敏检测技术的临床应用及其探讨张伟关键词:ATP生物荧光技术肿瘤药敏检测   化学治疗已经是治疗恶性肿瘤的常规有效手段之一，有资料显示肿瘤内科治疗及多学科的综合治疗已提高了癌症的疗效。然而，由于肿瘤本身特性的原因存在个体差异性，即便是同一组织学类型、分化程度相同肿瘤，对药物的敏感性和药物敏感谱也显著不同，肿瘤化学治疗疗效的不均一性是肿瘤临床医师一直要应对的重大挑战。   目前，化疗药物的疗效仍然较低。以胃癌为例，目前胃癌患者的单药化疗有效率仅为15%-30%，如常用药物丝裂酶素（MMC）有效率为30%，5-Fu有效率为21%，表

2、阿霉素（EDI）有效率为19%，联合化疗的有效率仅为30%-50%[1]。在大家公认具有较高的化疗疗效的乳腺癌的治疗新药紫杉醇（PTX）一线单药有效率为32-62%，二线有效率仅为26%-33%；泰索帝（TXT）单药有效率59%，而二线有效率仅为40%；长春瑞宾（NVB）初治有效率为40-44%，复治有效率仅为17-36%。其它的肿瘤化学治疗药物也普遍存在疗效低的问题。   肿瘤化学治疗药物本身局限性的影响，导致化疗和方案的选择不可避免的具有一定的盲目性。由于化疗药物多具细胞毒性,不当的治疗会产生严重的毒副作用和联合耐药，最终可能会导致治疗失败

3、。因此，如何能在患者化疗之前检测出该患者肿瘤细胞对药物的敏感性，提高化疗用药的针对性和准确性，准确预见体内治疗效果，从而为患者筛选出相对有效化疗药物，为临床医师较确定化疗方案和开展有的放矢的个体化治疗提供科学依据是摆在科学家面前亟待解决的重要课题。   建立能为患者和医生在体外检测、筛选相对有效抗肿瘤药物的技术，并实现该技术的产业化、操作流程标准化和评价标准规范化，对于提高肿瘤治疗用药的科学性和最大限度发挥已有药物的治疗作用具有重要意义。   肿瘤的体外药敏试验研究已经有数十年的历史，所及技术也有十余种。至2000年与临床有关的类似报道已逾50

4、00篇。大量国外临床研究表明肿瘤体外药敏检测与临床疗效存在一定的相关性；体外药敏检测能够较好的指导临床用药、提高临床疗效以及延长病人的生存期[2-10]。体外检测肿瘤对化疗药物的敏感性的主流方法包括软琼脂克隆形成实验（HTCA），四唑蓝比色法(MTT)，细胞毒性差异染色方法(DiSC)，胸腺嘧啶掺入法(H3-T)，立体组织培养法等。但由于这些方法在某方面存在较严重的技术缺陷而难于实现产业化和标准化（表1），导致各实验室间的研究结果可比性差，技术难于普遍推广应用。   因此，一种具有适当敏感性和具有较高特异性，可产业化、操作流程标准化、评价标准规

5、范化和操作自动化的技术是当今药敏技术成熟性的的标志。表1：常见体外药敏检测方法的技术缺陷[11]体外药敏检测方法存在问题软琼脂克隆形成实验（HTCA）标本易污染导致可评价率低（30-40%）实验周期长，需要4周以上测试药物种类和数量少方法难以标准化，各实验室间结果可比性差阳性预测值较低，仅有40～60%四唑蓝比色法(MTT)敏感性和重复性差，最低仅能检测500个细胞有效量程在2.0以内，敏感性不够细胞毒性差异染色方法(DiSC)可适用标本类型少，仅适用于血液肿瘤人为判断因素较大，技术难以推广标本可评价率不高，仅有50-60%阳性预测值较低，仅有

6、60-70%胸腺嘧啶掺入法(H3-T)实验人员接触放射，不利于健康和环保标本可评价率低，仅有70～80%测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞阳性预测值较低，仅有53～75%假阴性率高，重复性差1ATP-TCA技术原理和特点1.1技术原理   ATP生物荧光技术产生于七十年代中期。1983年，Moyer等提出内源性三磷酸腺苷(ATP)的数量可以反映细胞的活性度[12]。随后，Kangas（1984）、Kuzmits（1986）等相继证实该技术是一种敏感而可靠的确定各种细胞活性度的检测方法[13,14]。1988年，Sevin等将ATP生物荧光

7、技术应用于卵巢癌体外肿瘤药物敏感性检测（ATP-TCA），其主要技术原理为：      内源性ATP是活体细胞最基本的能量来源。细胞死亡时，ATP迅速水解。因此测定细胞内源性ATP的含量可以即时反映细胞的活性和活细胞数量[12-14]。荧光酶在有氧条件下,可以和荧光素结合后催化ATP转变成AMP,并且释放出荧光（波长为562nm），测定所产生的荧光强度,与标准曲线比较即可推测活细胞的数量。肿瘤细胞经体外给药培养后，计算出化疗药物各个系列浓度对培养细胞的不同抑制率，参照相应判断指标，从而评估该化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果[11,15]。1.2主要

8、技术流程ATP-TCA肿瘤体外药敏检测操作流程主要为（图1-1）[11,15]：1.2.1肿瘤单细胞悬液制备：本步骤操作先将新鲜瘤组织剪碎成大小1mm