双向电泳步骤--标准操作完整版

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1、双向电泳步骤--标准操作完整版导读：就爱阅读网友为您分享以下“双向电泳步骤--标准操作完整版”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对92to.com的支持!双向电泳一、储备液的配制：水化储液：尿素(MW60.06)7M10.5g硫脲(MW76.12)2M3.8gCHAPS(MW614.89)2%0.5g9加超纯水定容至25mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成50小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。1%溴酚蓝储液溴酚蓝1%1gTris-Base50mM0.6g加超纯水至100mL。30%T,2.6%C聚丙烯酰胺

2、贮液：（凝胶厚度1.5mm）丙烯酰胺146g甲叉双丙烯酰胺4g用超纯水定容至500mL，经0.22μm滤纸过滤后，使用棕色瓶于4℃冰箱保存。丙烯酰胺的计算：9T=（丙烯酰胺质量+甲叉丙烯酰胺质量）/总质量×100%=（丙烯酰胺克数+交联剂克数）/总体积（ml）×100%C=甲叉丙烯酰胺质量/（丙烯酰胺质量+甲叉丙烯酰胺质量）×100%=交联剂克数/（丙烯酰胺克数+交联剂克数）×100%C值高，孔径小，凝胶较硬；C值低，孔径大，适合跑蛋白质。1.5MTris-BasepH8.8：Tris-Base（MW121.1）90.75

3、g加超纯水至400mL用浓盐酸调pH至8.8（大约加入8ml），加超纯水定容至500mL。4℃冰箱保存。10%SDS：SDS10g9加超纯水至100mL，混匀后过滤，室温保存。电泳缓冲液：Tris-Base（FW121.1）25mM12g甘氨酸（FW75.07）192mM57.6gSDS(FW288.38)0.1%4g加入超纯水4L平衡储液：1.5MTris-CL（pH8.8）50mM16.75mL尿素(MW60.06)6M180.18g甘油30%（V/V）150mLSDS(FW288.38)2%（W/V）10g9溴酚蓝储

4、液（1%）0.002%（W/V）1mL加超纯水至500mL，40mL分装，-20℃保存。二、临用前配置溶液水化液：水化储液500uLDTT20mM3.5uLIPG0.5%2.5uL1%溴酚蓝储液0.002%1uL胶条平衡缓冲液A：平衡储液20mLDTT1%0.2g9充分混匀。胶条平衡缓冲液B：平衡储液20mL碘乙酰胺2.5%0.5g充分混匀，避光配制。低熔点琼脂糖封胶液：低熔点琼脂糖0.5%0.05g电泳缓冲液10mL溴酚蓝0.001%10?L（1%溴酚蓝）加热溶解至澄清，室温保存。10%过硫酸铵：9过硫酸铵0.1g超纯水

5、1mL三、操作步骤（一）第一向等电聚焦一向电泳的准备工作：1、使用清水冲洗胶条槽，并用牙刷认真刷洗胶条槽内槽以及正负两个电极，并使用StripHoLderCLeaningSoLution清洗胶条槽，之后用二级纯水冲洗干净，自然晾干，胶槽的盖子同样使用StripHoLderCLeaningSoLution清洗自然晾干或用吹风机吹干。2、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化储液或用吹风机吹干，置室温溶解，配制水化液。93、使用brandford法测量蛋白样品的相对上样浓度，计算上样量（每种蛋白样品上样量为150ug）。将每种蛋白溶

6、液的体积用水化液补充至250uL。震荡混匀样品后，以13200rpm4℃离心30min。4、使用酒精擦拭IPGphor的平板电极,以去除表面被氧化的部分,待酒精挥发完全之后备用。5、从冰箱取出-20℃冷冻保存的干胶条，于室温放置平衡10分钟。6、胶条槽平行的放在IPGphor的平板电极上，将处理好的样品均匀的加入到胶条槽中，取室温平衡的胶条，用镊子轻轻的去除预制干胶条的保护膜，分清胶条的正负极，胶面向下放入胶条槽中，胶条吸胀15min-30min。7、在每根胶条上加入1mL覆盖油，可继续吸胀30min，加入覆盖油的作用是防

7、止胶条水化过程中液体的蒸发。细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方氯化钠(MW58.44)130mM98g氯化钾(MW74.5)2.7mM0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW358)10mM3.63g磷酸二氢钾(MW136)2mM0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。Washingbuffer（500mL）配方Tris（MW121.1）10mM0.605g蔗糖（MW342）250mM42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22μm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）9