双向电泳操作步骤

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1、3.1全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。参照Coelho等（Coelhoetal.2004）的方法，略有改动。用Washbuffer（10mmol/LTrisClpH8.0，5mmol/L醋酸镁）清洗细胞3次。离心，细胞沉淀在LysisBuffer(7mol/L尿素，2mol/L硫尿，1%IPGBufferpH3-10或pH4-7，4%CHAPS，1%DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。置于冰上裂解2h。13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。用2-Dclean-upKit纯化蛋白，再用2-DQu

2、antKit测定样本中蛋白浓度。3.22-DClean-UpKit的使用方法（全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。加入300μL沉淀剂。振荡或倒置搅匀。冰浴中（4~5℃）培育15min。2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。后离心5min，去上清。4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。将管振荡5~10s，这时沉淀应散

3、开，但并未溶解于水中。在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。小心地将上清液移走弃去。此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min，去掉所有不溶物质，除去泡沫。上清液可以直接加载到第一向IEF电泳胶上，也可以移至另一个管中，在-80

4、℃下保存以备日后分析。3.32-DQuantKit的使用方法1）用2mg/mL浓度的BSA标准溶液制备标准曲线（0~50μg）。2）制备含1~50μL待测样本的微型离心管，一式两份。有效检测范围是0.5~50μg。3）每个微型离心管中（包括含BSA标准溶液的离心管）加入500μL沉淀剂。振荡并在室温下培育2~3min。4）加入500μL辅助沉淀剂，短暂混匀。5）离心（至少10000r/min）5min。弃去上清液。再次短暂离心将残余的上清液集中至管底，用微量移液管吸去残余的上清液。操作要快，避免离心沉淀再溶或分散开。此时应无可见的液体成分残留。5）每个管中加入100μL铜溶液和400μL蒸

5、馏水或去离子水。振荡使沉淀的蛋白质溶解。应彻底振荡混匀，确保沉淀完全再溶解。6）每个管中加入1mL工作比色剂，应确保以最快的速度加入，使之与样本立即相混。在室温下培育15~20min。采用分光光度计，如Ultrospec1100proUV/可见光分光光度计，测定样本和标准液的480nm波长吸光率。7）根据标准溶液蛋白质含量的吸光率，标绘标准曲线。将样本与标准曲线比较，得到样本蛋白质浓度。3.4双向电泳主要是依据GEHealthcare公司双向电泳操作手册进行，并参考GEHealthcare描述方法进行一些改进(Berkelmanetal.1998)。3.4.1一向等电聚焦（IEF）13cm

6、pH3-10的胶条每胶条上样150μg蛋白。24cmpH4-7的胶条，每胶条上样300ug蛋白。胶条上样后于20℃水化l2h。水化好的胶条移至EttanIPGphorIII水平电泳仪按照：S100v1h，S200v1h，S500v1h，G1000v1h，G10000v3h，S10000v8h至等电聚焦完成。等电聚焦结束后,迅速取出IPG胶条,先置于平衡液A(6mmol/LUrea，2%SDS，75mmol/LTris-HClpH8.8，29.3%甘油，1%DTT，痕量溴酚蓝)平衡15min后，再将胶条置于平衡液B(6mmol/LUrea，2%SDS，75mmol/LTris-HClpH8.

7、8，29.3%甘油，2.5%碘乙酰胺，痕量溴酚蓝)平衡15min。3.4.2二向SDS-PAGE（缓冲液全部是新鲜配制）将平衡好的胶条转入EttanDALTsix垂直电泳槽中进行第二向电泳，聚丙烯酰胺凝胶浓度为12%，电泳条件为每胶1W，电泳1h，然后每胶20W直至溴酚蓝指示线到达凝胶底部停止电泳。3.4.3银染将凝胶在玻璃板上剥离下来后，置于固定液(40%无水乙醇)30min，倒去固定液，换敏化液(30%无水乙醇10%