国标-口蹄疫病毒荧光rt-pcr检测方法

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1、ICS11．220B41固冒中华人民共和国国家标准GB／T22915—2008口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法ProtocolofuniversalfluorogenicRT—PCRforfootandmouthdiseasevirus2008-12-31发布2009—05—01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局借寿中国国家标准化管理委员会厘111GB／T22915—2008刖罱本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)》(第5版)。本标准的附录A、附录C为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动

2、物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：花群义、杨云庆、秦智锋、周晓黎、卢体康、董俊、陶虹、阮周曦、叶弈优、林祥梅、吴绍强。GB／T22915—2008口蹄疫病毒荧光RT—PCR检测方法1范围本标准规定了口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于动物及其动物产品中口蹄疫病毒的检测。2缩略语下列缩略语适用于本标准。2．1荧光RT-PCR荧光反转录一聚合酶链反应。2．2Cf值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。2．3RNA核糖核酸。2．4DEPC焦碳酸

3、磷酯。2．5PBS磷酸盐缓冲盐水，配方见附录A。2．6Taq酶TaqDNA聚合酶。2．7FMDV口蹄疫病毒。3原理根据E1蹄疫病毒各型共有的基因特定序列的保守片段，合成一对通用的特异性引物和一条通用的特异性探针。荧光探针的57端标记FAM荧光素，37端标记TAMRA荧光素，3’端的淬灭基团在近距离内能吸收5r端报告荧光基团发出的荧光信号。但在扩增时，由于Taq酶的51—37的外切活性，在延伸到荧光探针时，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。4材料与试剂4．1仪器与器材4．1．1荧光RT—PCR检测仪。4．1．2高速台式冷冻离心机(离心

4、速度12000r／rain以上)。4．1．3台式离心机(离心速度3000r／min)。4．1．4混匀器。4．1．5冰箱(2℃～8℃和一20℃两种)。4．1．6微量可调移液器(5pL，10pL，100pL，1000pL)及配套带滤芯吸头。4．1．7Eppendorf管(1．5mL)、透明薄壁PCR管(O．2mL)。GB／T22915—20084．2试剂4．2．1除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。4．2．2三氯甲烷。4．2．3异丙醇：一20℃预冷。4．2．4PBS：配制见附录A。4．2．575％乙醇：用新开启的无水乙醇和D

5、EPC水配制，--20℃预冷。4．2．6引物：上游引物5’一TTAcAAACCTGTGATGGccTC_3’，下游引物5'-CGGAGATCAACT—TCTCCTGTATG-37。4．2．7荧光双标记探针(10pmol／L)：(FAM)51_ccTcTccTTTGcACGccGTGp37(TAMRA)。4．2．8口蹄疫病毒通用荧光RT—PCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项参见附录B。5抽样5．1采样工具5．1．1下列采样工具应经121℃土2℃，15rain高压灭菌并烘干。5．1．2棉拭子。5．1．3剪刀、镊子。5．1．4注射器。5．1．51．5mLEppendorf管。5．1．6研钵。5

6、．2样品采集5．2．1采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织、水泡液、血液、口腔分泌物和组织。采集后立即冷藏送检或置于含抗生素的PBS缓冲液中低温保藏。编号并作好记录。5．2．2水泡液及水泡皮：用75％酒精轻轻消毒水泡表皮，去掉污物，用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓冲液灭菌瓶中。水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放人含抗生素的PBS缓冲液中。5．2．3口腔分泌物和咽喉拭子：用拭子采取口腔分泌物或将拭子深人口腔内来回刮3次～5次取分泌液，拭子一并放人盛有1．0mL含抗生素的PBS缓冲液的1．5mLEppendorf管中。也可用食道探杯刮取咽

7、喉液体，放人加有抗生素的PBS中。编号，冷藏送检或低温保藏。5．2．4血液：用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌Eppendor{管中，密封、编号后保存于4℃或送检。5．2．5肌肉或组织脏器：无菌采集待检样品，装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，冷藏送检或低温保藏。5．3样品贮运样品采集后，放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放入一个塑料袋内)，于保温箱中加冰、密封，送实验室。5．4样品制备