口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型荧光RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41团体标准T/CVMAX24—2019口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型荧光RT-PCR检测方法Real-TimeRT-PCRforDetectionofFootandMouthDiseaseVirusesserotypeO,AandAsia1（征求意见稿）CVMA中国兽医协会2019-xx-xx发布2019-xx-xx实施中国兽医协会发布T/CVMAX24—2019前言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准不涉及专利。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所、中国动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：刘湘涛、何

2、继军、林密、马维民、杨光、杨亚民、高鹏程、靳野、郑海学、郭建宏、王传彬、刘玉良CVMA中国兽医协会IT/CVMAX24—2019口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了口蹄疫病毒O、A和Asia1型分型荧光RT-PCR检测技术要求和结果判定。本标准适用于临床发病动物水泡皮、水泡液、反刍动物食道-咽部分泌物（O-P液）及其他组织和病毒培养物中口蹄疫病毒核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物

3、安全通用要求GB/T18935口蹄疫诊断技术GB/T27528口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法3试剂3.1总RNA提取试剂CVMA3.1.1无核酶水：中国兽医协会将焦碳酸二乙酯（DEPC）按0.1%的量（w/v）加入三蒸水中制备的无DNA酶和RNA酶水（附录A.1）。推荐使用商品化无核酶水。3.1.2Trizol裂解液：商品化试剂，4℃保存。3.1.3三氯甲烷：分析纯，常温保存。3.1.4异丙醇：分析纯，常温保存。使用前预冷至-20℃。3.1.575%乙醇：无水乙醇（分析纯）与无核酶水按3:1配制而成。使用前预冷至-20℃。2T/CVMAX24—20193.1.6核酸提取等效方法和

4、试剂：可采用等效RNA提取方法，如采用离心柱、磁珠法、自动化核酸提取仪等提取核酸，分别使用配套试剂。3.2Real-timeRT-PCR试剂2×Real-timeRT-PCR缓冲液、热启动TaqDNA聚合酶(5U/µL)、PrimeScript反转录酶混合液、RNA酶抑制剂（40U/µL）。3.3引物和探针序列O型上游引物序列为：5’-GCTCTTTCCCCACCAGTTCA-3’；下游引物序列为：5’-TTGTACTGGTCGTAGCGGTTGA-3’；探针序列为：5’-CGGACGAACATGACGGCGCACA-3’，其5’端和3’端分别标记FAM和BHQ。A型分型上游引物序列为：

5、5’-TTGCACTTCATGTTTACTGGCT-3’；下游引物序列为：5’-CGTGTCCCATTCTGCGTGG-3；探针序列为：5’-ACGCCACCGGACACACCTGAGAA-3’，其5’端和3’端分别标记CY5和BHQ。Asia1型分型上游引物序列为：5’-CCGACGGCTTCACACTGA-3’；下游引物序列为：5’-AGAAGTAGTACGTCGCAGACC-3’；探针序列为：5’-CTCACCCAGCCCAAGAGCACCC-3’，其5’端和3’端分别标记HEX和BHQ。配制反应体系时，3条上游引物、3条下游引物和3条探针分别等量混合，成为混合上游引物、混合下游引

6、物和混合探针。CVMA3.4阳性对照和阴性对照中国兽医协会3.4.1阳性对照：口蹄疫病毒培养物灭活抗原。3.4.2阴性对照：无核酶水。4主要仪器设备荧光PCR仪、组织匀浆器、高速台式冷冻离心机、生物安全柜等。5操作步骤3T/CVMAX24—20195.1样品采集样品采集按照GB/T189355.3进行。5.2样品处理5.2.1生物安全措施：样品处理过程中的生物安全要求和措施，按照GB19489进行。5.2.2组织样品处理：将采集的发病动物病料或组织，置组织匀浆器中充分研磨，0.04mol/LPBS（pH7.4）（附录A.2）制成1:5~1:10组织悬液，4℃浸毒，3000r/min离心1

7、0min，取上清液备用。5.2.3水泡液、O-P液样品处理：直接用于检测。5.2.4病毒培养物：病毒接种本动物、实验动物后的发病病料等组织样品，按照5.2.2处理。病毒接种细胞培养物直接检测。5.3病毒RNA提取5.3.1若使用传统的Trizol裂解方法提取病毒RNA，参照以下步骤进行操作。5.3.1.1取已处理的待检样品、阳性对照和阴性对照各200µL，分别置于1.5mL离心管中，每管加入1000µLTrizol裂解液，充分混匀，