光合细菌分离方法的优化研究

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1、光合细菌分离方法的优化研究摘要:以污水处理厂污泥中光合细菌为材料，对其进行了分离方法的优化。采用半固体试管法、双层平板涂布法、平板稀释分离法、Hungate滚管法、双层平板划线法对光合细菌进行了分离试验研究，比较各分离方法的优缺点。关键词:光合细菌;分离方法;厌氧;优化光合细菌(Photosyntheticbacteria，PSB)广泛分布于淡水、海水、极地或温泉(包括高热水体)以及高盐、高有机质含量等不同的生态环境中，是一类进行不产氧光合作用、具有复杂代谢功能的微生物。它能利用多种基质，可以异

2、养、自养或兼性营养;存在着好氧、厌氧和兼性厌氧类型［1］，具有较强的分解有机物特性，作为净化剂和饲料广泛应用于水产养殖和畜禽养殖［2～5］。光合细菌属于水圈微生物中的一类，大部分PSB是从土壤、水沟和污泥中分离得到。由于PSB在厌氧条件下更易生长，且分离技术要求高，很难富集并分离到活性高的光合细菌。对光合细菌的多种分离方法进行比较，分析不同分离方法的效果。1实验材料和方法1.1样品来源光合细菌采自污水处理厂污泥，经富集培养，分离纯化，获得红假单胞菌属的光合细菌。1.2培养基富集培养基:CH3CO

3、ONa3．0g;CH3CH2COONa0．3g;NaCl1g;(NH4)2SO40．3g;MnSO425mg;K2HPO40．3g;KH2PO40．5g;CaCl20．05g;MgSO4·7H2O0．2g;FeSO4·7H2O0．005g;酵母膏0．1g;蛋白胨0．01g;蒸馏水1000ml;pH7．0［6］。分离培养基:CH3COONa3．0g;CH3CH2COONa0．3g;NaCl0．5g;NH4Cl1g;MgSO4·7H2O0．2g;K2HPO40．3g;KH2PO40．5g;CaCl2

4、0．05g;MnCl2·4H2O0．003g;FeSO4·7H2O0．005g;酵母膏0．1g;蛋白胨0．01g;谷氨酸0．0002g;蒸馏水1000ml;琼脂20g;pH7．2～7．4;121℃高压灭菌30min。R培养基:CH3COONa3．0g;NaHCO31．0g;NH4Cl1．0g;K2HPO40．5g;MgCl20．2g;FeCl2-EDTA0．005g;NaCl5．0g;抗氧化剂0．25g;琼脂粉8g;蒸馏水1000ml，pH7．4±0．2;121℃，灭菌15min。1.3制备样品

5、稀释度以无菌操作取25ml样品，放入装有225ml无菌水的灭菌三角瓶内，混匀。用10ml的灭菌移液管准确吸取10ml的样品匀液放入装有90ml稀释剂的三角瓶，混匀，制成1∶100的样品液，依此类推，将菌液稀释至10－6，10－7，10－8［7］。1.4分离方法1.4.1半固体试管法取光合细菌不同稀释度0．5ml或1ml于试管，迅速倒入灭菌后的R培养基20ml(温度为50℃左右)，待凝固后上层覆盖5ml1%灭菌纯琼脂。同时用稀释剂做空白对照，于光照培养箱培养［8］。1.4.2双层平板涂布法取光合细

6、菌不同稀释度0．5ml和1ml菌液，在已经置备好无冷凝水的装有分离培养基平板上均匀涂布，同时上层覆盖分离培养基保持厌氧。室温放置1h，用封口膜封口，30℃，1500～2000lx光照强度下厌氧培养［9］。1.4.3平板稀释分离法取光合细菌不同稀释度0．5ml和1ml菌液与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾人灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平*收稿日期:2011－03－07基金项目:辽宁省科技攻关项目(2005229003);辽宁省科技厅项目(20060117-

7、232);辽宁大学“211”三期重点学科资助项目作者简介:徐成斌(1980－)男，汉族，辽宁省大连市人，讲师，主要从事环境微生物学研究。E-mail:xuchengbin80@163．com通讯作者:马溪平(1957－)女，汉族，辽宁省沈阳市人，教授，主要从事环境工程微生物学研究。辽宁农业科学2011年板，同时上层覆盖一层分离培养基保持厌氧，保温培养一定时间即可出现菌落，用接种环将不同特征的单个菌落挑出，接种到相应的液体培养基中培养［7］。1.4.4Hungate滚管法［10］固体培养基的滚管技

8、术是指将装有热熔培养基的厌氧管放入装有冷水的平底盆中迅速不断转动而制成。当琼脂围绕管壁完全凝固后，琼脂滚管即可垂直放置贮存，并可使少量未凝结的水分集中在底部。用注射器将不同稀释度的菌液射入已滚好的厌氧管中培养，灭菌厌氧管接种时，橡皮塞在火焰上灼烧，稍冷后通过橡皮塞注入菌液，30℃，1500～2000lx光照强度下厌氧培养，待出现单菌落，接种到相应的液体培养基中培养。1.4.5双层平板划线法用灼烧后的接种环挑取一环细菌悬液，在已经制备好的装有分离培养基的平板上划线，之后用15～20ml融化后冷却至