目的蛋白表达与纯化protocol

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1、目的蛋白表达与纯化protocol小量表达测试：1、挑一单克隆到3mlLB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。2、保种：700μl菌液+400μl80%灭菌甘油，充分混匀后置于-800C保存。3、扩大培养：以1:100接菌，即取50μl菌液到5mlLB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养2h~3h至OD值达到0.6。4、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。对照5、另取1ml菌液于一新的试管中，加1/1000IPTG（终浓度为1m

2、M），370C，220rpm振荡培养3h后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。370C样品6、其余约3ml菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。160C样品7、Bugbuster分别处理上述三个样品，取20μl总蛋白，其余离心后分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳鉴定，上样顺序为：对照370C样品16

3、0C样品总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀若目的蛋白在上清中有表达，则可以进行大量表达与纯化，具体操作如下。大量表达：1、挑一单克隆到7.5mlLB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。注意：此步用50ml离心管摇菌！2、扩大培养：以1:100接菌，即取将上述7.5ml菌液全部接到750mlTB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养4h~5h至OD值达到1.0。3、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。（对照）4、其余约菌液于

4、160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：6000rpm、40C离心10min，弃尽上清，取一点沉淀做表达鉴定（160C样品），其余-200C保存。1、Bugbuster分别处理上述两个样品，进行SDS-PAGE电泳鉴定。（同小量表达中的7）菌体破碎（高压破菌法）：1、若目的蛋白在上清中有表达，则可取剩余菌体Ng(根据目的蛋白的表达量而定)，用4-6×Nml的lysisbuffer将菌体重悬，加

5、入0.1mM的PMSF，置于50/100ml小烧杯中，并将烧杯置于冰上。2、用超声破碎仪进行破碎，功率一般为100W~200W，超声时间为3s，间隙时间为5s，工作次数一般为99×4次。3、将破碎后的菌液移入50mlBECKMAN高速离心管中，18000rpm、40C离心30-40min，将上清移入一个新的50ml离心管中。Ni柱亲和层析：Lysisbuffer:50mMTris,300mMNaCl,pH8.0（可加入5-10%的甘油和1mMdTT，20mM咪唑）Washbuffer:50mMTris,30

6、0mMNaCl,20mM咪唑,pH8.0Elutionbuffer:50mMTris,300mMNaCl,500mM咪唑,pH8.01、取适量的beads灌入玻璃柱中，用大量的ddH2O冲洗beads，一般为10CV×5（CV代表柱体积，下同）。2、用lysisbuffer进行平衡：10CV×5。3、将平衡好的beads移入菌体破碎最后得到的上清中，Mix1~2h。4、500g，40C离心2min，收集上清——flow-through。5、加入50mlwashbuffer，500g，40C离心2min，收集

7、上清——wash1。6、加入50mlwashbuffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash2。7、加入50mlwashbuffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash3。8、将beads灌入玻璃柱中，继续用washbuffer洗10CV×3。9、用Elutionbuffer洗脱：0.5CV×10，用EP管分别收集eluates。10、SDS-PAGE电泳鉴定。Resinregeneration:1、用0.1MEDTA洗2CV（清洗至beads为无色）。2、ddH2O洗5CV

8、。1、0.1MNaOH洗2CV。2、ddH2O洗5CV。3、加2CV的NiCl2。4、ddH2O洗5CV。5、用20%乙醇洗2次beads，置于4~80C保存。GST柱亲和层析：Lysisbuffer:1×PBS(140mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.3)Washbuffer:1×PBSElutionbuffer:50mMTris,10mMreducedgl