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1、Protocol蛋白质纯化方法（镍柱）柱前操作1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min;2.用BindingBuffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质；3.取上清，12000r/m离心20min,得包涵体；4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱；平
2、衡柱子（柱体积：V）7.3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）；8.5VChargeBuffer（CB);？？？9.3VBB;柱层析10.上样；11.10VWashingBuffer（WB）；12.6VEluteBuffer（EB);13.分管收集，每管1~2ml.各种缓冲液配方1.8×BB:4MNaCl,160mMTris-HCl,40mMimidazole(咪唑），pH=7.91000mlNaCl:58.44×4=233.76gTris-HCl:121.14×160×10-3=19.3824gImidazole:68.08×40×10-3=2.7
3、232g2.8×CB:400mMNiSO41000mlNiSO4:262.8×400×10-3=105.12g3.8×WB:4MNaCl,160mMTris-HCl,480mMimidazole,pH=7.91000mlNaCl:233.76g,Tris-HCl:19.3824g,Imidazole:32.6784g4.4×EB:2MNaCl,80mMTris-HCl,4Mimidazole,pH=7.91000mlNaCl:118.688g,Tris-HCl:9.6912g,Imidazole:272.32g5.6M尿素1000ml尿素：60.06
4、×6=360.36g9Ni柱纯化蛋白注意事项(2011-10-1316:01:39)使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白，是我们大家再熟悉不过的实验操作了。我们对整个操作的流程及注意事项，很可能是师从兄师姐那里获得的。这些经验都是大家智慧的结晶。同时，这也有一定的不足之处，那就是我们学习到的是局部，还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿，那些知识我们应该从哪里掌握呢？给大家推荐一个办法，那就是参考那些大公司的实验手册。一般像GE、Qiagen等知名公司，都有Ni柱柱材料的产品，因此关于柱材料的各种性质参数，以及使用方法和注意事项都有详细的说明。
5、下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips，仅供参考。1.避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等；2.各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等；3.各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；4.不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；5.在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；6.缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）7.应避免含碳酸氢钠
6、，柠檬酸等物质；8.缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；9.可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿素（最高可8M）10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；？？？Ni柱纯化His-tag蛋白质一 非变性条件下抽提His-Tag蛋白质 下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（HisTagProtein）的具有天然结构的可溶性重组蛋白质（NativeProtein）。其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-Tag结构，提供的层析方法可供参考。9
7、1.样品准备1)准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.5-0.8时，用1mMIPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70度或立即进行步骤2操作。2)加入1/20细胞生长体积的NTA-0Buffer（20mMTris-HClpH7.9，0.5MNaCl，10%Glycerol）和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作浓度位1mM；注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。该步骤冰上操作。3)将细胞悬浮起来，加入溶菌酶（工作浓度位0.2
8、-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混匀，冰上放置30分钟，
