autotaxin多克隆抗体的制备

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1、Autotaxin多克隆抗体的制备作者：李颂,姜望舒,邱洋,张俊杰【摘要】　　目的:表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的Autotaxin（58157位氨基酸）融合蛋白,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法:构建pET21cAutotaxin(58157)重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗Autotaxin的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Westernblot检测抗体特异性,并用于免疫组化实验。结果:在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58

2、157)His6融合蛋白,经亲和纯化后免疫家兔,获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论:成功构建pET21cAutotaxin(58157)表达质粒,原核表达获得高纯度的目的蛋白,制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。【关键词】Autotaxin;原核表达;多克隆抗体　　Autotaxin（ATX）是一个分泌型糖蛋白,具有5核苷磷酸二酯酶（phosphodiesterase,PDE）活性,是胞外焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ectonucleotidepyrophosphate/phosphodiesterase,ENPP

3、s）家族的一员［1］。ATX还具有溶血磷脂酶D（lysoPLD）活性,能够以溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidycholine,LPC）为底物催化生成溶血磷脂酸（lysophosphatidicacid,12LPA）［2］。通过对ATX缺失杂合体小鼠和野生型小鼠的比较发现,ATX缺失杂合体小鼠血清中LPA的含量和ATX的活性均为野生型小鼠的一半。这一结果从整体上进一步表明ATX是体内催化产生LPA的重要物质［3］。LPA作为一种能够与Edg家族G蛋白偶联受体结合的脂类信号分子,与肿瘤关系密切。它可以促进癌细胞增殖、分化、调节细胞间相互作用

4、,抑制细胞死亡,提高细胞的运动性、侵染性,并促进细胞产生细胞因子［4］。　　ATX在很多肿瘤细胞中都有高表达,在肿瘤的发生、发展过程中有着重要作用,被认为是肿瘤治疗中一个可能的靶位［5］。此外,ATX在神经系统［6］、免疫系统［7］中也发挥重要作用。以往研究结果表明,ATX可以作为一些肿瘤的诊断、预后标记。例如,有研究发现ATX可以作为眼色素层黑素瘤患者预后状况的判断指标［8］;ATX含量在术后前列腺癌患者体内下降,它可能成为前列腺癌的预后指标［9］。最近有研究发现在慢性丙肝患者的血清中ATX表达量显著上调,认为ATX可能在肝癌的发生过程中起关键作

5、用［10］。基于ATX在肿瘤发生、发展中的重要作用,对其表达调控机制的研究和抑制剂的开发成为研究热点。制备高效价、高特异性的抗Autotaxin多抗将有助于与Autotaxin相关的理论和应用研究。　　1材料和方法　　1.1材料pET21c原核表达载体、12BL21大肠杆菌菌株由本实验室保存。人卵巢癌细胞株SKOV3由ATCC购买。SKOV3培养于含有100U/mL青霉素（Invitrogen）、100U/mL链霉素（Invitrogen）,2mmol/L的L谷氨酰胺（Invitrogen）,100mL/L胎牛血清（Hyclone）的RPMI1

6、640培养基（Gibco）中。培养于含50mL/LCO2,37℃的恒温培养箱中（Thermo）。异丙基β硫代半乳糖苷（IPTG）购自Merck公司;TRIzol购自Invitrogen公司;反转录试剂盒购自Promega公司;限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;NiNTAResins购自Novagen公司;BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。羊抗兔辣根过氧化物酶偶联抗体购自中杉金桥生物技术有限公司。　　1.2方法　　1.2.1pET21cAutotaxin(58157)原核表达质粒的构建从

7、高表达Autotaxin的人卵巢癌细胞系SKOV3中抽提细胞总RNA,用Promega反转录试剂盒合成cDNA。PCR扩增Autotaxin蛋白58157位氨基酸对应的cDNA。PCR引物由上海生工生物技术公司合成,序列如下:上游引物5′GGAATTCATATGTCTTGCAAGGGCAGGTGC3′,下游引物5′CCGCTCGAGGCATTCTGCGGCCTTTATTTC3′。PCR扩增条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸40s（30个循环）;72℃10min。选用NdeI、XhoI酶切位点,将

8、PCR产物克隆入pET21c质粒,转化BL21大肠杆菌菌株。12　　1.2.2Autotaxin(58157)His