多克隆抗体的制备方法

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1、多克隆抗体的制备方法多克隆抗体的概念：由多个B淋巴细胞克隆所产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体。多克隆抗体的制备主要包括以下几个步骤：免疫动物、佐剂、免疫原、免疫、取血等。多克隆抗体的制备步骤一、器材剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等

2、。二、试剂生理盐水(或PBS)弗氏完全佐剂(Freund’scompleteadjuvant，FCA)弗氏不完全佐剂(Freund’sincompleteadjuvant，FIA)二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2%NaN3三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。四、兔子的选择兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。五、免疫用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后

3、大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。注：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可

4、注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。六、取血：免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。前几次取血用19

5、号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：1、家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。2、沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌(小心操作，如碰到小血管出血，可用止血钳止血)。3、用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织。4、于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心

6、端的动脉用血管夹夹住。5、用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口(勿剪断)，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。6、松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。七、血清的分离如果用三角瓶或平皿盛血，将器皿倾斜放置于37oC烘箱2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集，37oC烘箱放置2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上离心，10000RCF，10分钟。在血清中加入NaN3至终浓度

7、0.02%，分装后-20oC保存。小结：抗血清获得之前要件的抗体的效价、抗体的特异性以及抗体的亲和力；获得抗血清之后，要分装保存抗血清，一般情况下，-20度可保存数月至数年抗体的效价都不会发生变化。抗体的效价可以通过琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验进行鉴定。来源：生物帮http://v.bio1000.com/list-253.html生物视频,生物教学视频,生物实验视频,生物化学视频,生物化学精品课程,生物精品课程,生物视频讲座,生物科普视频http://v.bio1000.com/list-19

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