β细胞素对胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的影响

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1、β细胞素对胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的影响【摘要】目的:探讨大鼠β细胞素在胰腺干细胞的增殖和转分化为胰岛细胞中的生物学作用。方法:分离并培养大鼠胰腺干细胞于CMRL1066和无血清DMEM/F12培养液中,不同浓度大鼠β细胞素处理后,双硫腙染色,放免法检测胰岛素分泌量。结果:在大鼠β细胞素浓度为20～30mg/L时,大鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的数量明显高于对照组;其胰岛素分泌量明显高于对照组(P<0.01)。结论:大鼠β细胞素具有促进胰腺干细胞转分化为胰岛β细胞并增强其胰岛素分泌的作用。【关键词】β细胞素;糖尿病胰腺干细胞胰岛移植是治疗糖尿病的一个热点,但供体的缺乏和存在免疫

2、排斥反应限制了其应用。胰腺干细胞能定向分化成胰岛细胞,这为胰岛移植提供了新的材料来源［1］。细胞生长因子在干细胞的发育和分化中发挥了重要作用。研究表明,β细胞素（betacellulin,BTC）属于表皮细胞生长因子家族中的一个成员,具有多种生物学功能,胰腺BTCmRNA的高水平表达,提示BTC可能在胰腺组织的发育中发挥重要的生理作用［2,3］。本研究中通过建立稳定的胰腺干细胞体外培养方法,11将β细胞素用于胰腺干细胞的体外培养,观察其是否能促进胰腺干细胞转分化为成熟的胰岛,为克服胰岛移植时的供体短缺提供新的胰岛来源。　　1材料和方法　　1.1材料　　SD大鼠（体质量250g,雌雄不限,饲养于

3、清洁级动物房自由饮水和进食,手术前1d禁饮食）由第四军医大学动物中心提供,Ⅴ型胶原酶、Histopaque(1.119kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、Histopaque(1.077kg/L)、碱性成纤维细胞生长因子2(basicfibroblastgrowthfactor2,bFGF2)、角朊细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor,KGF)、ITS(insulintransferin　selenium)购自Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA)购自杭州四季青生物制品公司;双硫腙（dithizone,DTZ）、二甲基亚砜（DMSO）、烟碱

4、购于华美公司;兔抗小鼠的PDX1和CK19抗体购自北京中山生物工程有限公司;免疫组化SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司;CMRL1066、DMEM/F12购于Gibco公司;胰岛素放射免疫分析试剂盒购于北京北方生物技术研究所;大鼠β细胞素由本研究室采用基因工程方法获得［4］。11　　1.2方法　　1.2.1大鼠胰腺干细胞的分离、培养　　采用宋振顺等［5］的方法,首先以Ⅴ型胶原酶消化成年SD大鼠胰腺组织,然后采用非连续密度梯度离心法纯化消化后的胰腺细胞,去除胰岛细胞后,收集外分泌部细胞进行培养。所获的细胞培养在含100mL/L胎牛血清的CMRL1066培养液中,其中添加100U/

5、mL青霉素、100g/L链霉素、500μg/L二性霉素B。第3天将培养液改为DMEM/F12,其中加入ITS（5mU/L胰岛素+5mg/L转铁蛋白+5mg/L硒）500μg/L二性霉素B,2g/L牛血清白蛋白、10mmol/L烟碱,0.01ng/LKGF等。此后每2～3d换液1次。于相差显微镜下观察细胞生长状况和克隆形成情况。　　1.2.2胰腺干细胞免疫组织化学染色　　分别取培养3、7、14d后的细胞爬片,0.4g/L多聚甲醛(PFA)固定后,PBS缓冲液冲洗玻片,分别与兔抗小鼠PDX1、CK19抗体4℃反应过夜,二抗及呈色反应参照SP试剂盒说明。二氨基联苯胺(DAB)显色,显微镜观察,自

6、来水冲洗,苏木精复染,中性树胶封固。阴性对照用PBS代替一抗。11　　1.2.3双硫腙染色与计数　　双硫腙(DTZ)为螯合剂,可与铅、铜、锌等螯合,人和动物（豚鼠除外）的胰岛β细胞因含有锌,双硫腙染色呈猩红色,其他胰岛细胞不着色。配制及染色方法:用二甲基亚砜（DMSO）配制:DTZ10mg溶于10mLDMSO,用Hanks（pH7.8）1∶100稀释,0.22μm滤膜过滤,DTZ与胰腺干细胞培养后转分化形成的克隆混合,室温5～10min后做镜检。按胰岛的直径>50μm计数染色的胰岛样细胞团,<50μm者不计。　　1.2.4胰岛素检测　　胰腺干细胞转分化后形成的胰岛克隆对葡萄糖刺激有

7、胰岛素分泌反应。显微镜下挑取100个胰岛样细胞团克隆,培养于24孔培养板,先用含低糖（5.5mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育1h后,更换为含高糖（16.7mmol/L）加烟碱（10mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育2h后,取培养液上清,采用放免法测定胰岛素含量。　　1.2.5实验分组11　　按照实验方法1.2.1中胰腺干细胞的培养方法培养大鼠胰腺干细胞,并将其