一种简便高效利用重叠延伸pcr进行基因定点突变的方法

《一种简便高效利用重叠延伸pcr进行基因定点突变的方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、一种简便高效利用重叠延伸PCR进行基因定点突变的方法作者：苏燕邵国高嵩单于明华修瑞娟【摘要】　　目的：建立一种简便快速的重叠延伸PCR基因定点突变方法。方法：采用重叠延伸PCR的方法将人TGF-β2基因启动子区（-270bp~+280bp）-114bp的5'CGTG3'序列定点突变为5'TTTG3'，前两次PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需纯化，直接将胶条切下置于EP管中，-80℃冷冻10min，然后将胶条离心后分别取上清液作为模板进行第三次PCR，以获得全长的突变目的基因，最后将此突变基因插入报告载体pGL3-Basic进行基因测序。结果：人TGF-β2基因启动子区突变序列的测序结果与

2、预期完全一致。结论：此方法简便经济、突变准确，是一种非常实用的基因定点突变方法。【关键词】重叠延伸PCR；基因突变；基因测序Overlap-extensionPCRwasusedtomutagenatehumanTGF-β2genepromoter(-270bp~+280bp）-114bpregionfrom5'CGTG3'to5'TTTG3'.ThefirsttwoPCRproductswereelectrophoresisedonagarose-gel,insteadofpurification,theaimedsegmentsgelwerecutdownandputintoEPat-80

3、℃for10-20mincool,thenthegelwerecentrifugedandthesupernatantswereusedas6templateforthethirdPCR.ThefinalPCRsegmentwasclonedintopGL3-basicforsequencing.Results:huamanTGF-β2genepromotermutanthadbeensuccessfullyconstructed.Conclusion:Themethodwaseffectiveandsimpleforsite-directedmutagenesisconstruction.K

4、eywordsOverlap-extentionPCR;Mutagenesis;Genesequencing随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段，在基因表达及蛋白质的结构与功能之间关系等方面的研究中得到广泛的应用。常用的定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变。目前，PCR介导的定点突变技术是使用最普遍的定点突变方法，以PCR为基础的突变方法一般有大引物突变、重叠延伸突变及一步快速突变。重叠延伸突变PCR可以在DNA区段的任何位置突变，且可以在侧引物的两端设计酶切位点，方便进一步的连接克隆[1-2]。本研究对传统

5、重叠延伸PCR法进行定点突变的实验方法进行了改进，进一步节约了实验成本，缩短了实验周期，是一种简便、经济、快速、准确的基因定点突变方法。　　1材料与方法6　　1.1材料PyrobestTaqDNAPolymerase、dNTP、T4DNA连接酶、限制性内切酶MluⅠ和BglⅡ及琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司，凝胶回收和质粒提取试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司，报告载体pGL3-Basic购自Promega公司。引物（引物1：5'GTATCAACGCGTAAAACGGGAGACTTGATTGT3',引物2：5'GATCTAAGATCTATTGCTCGCTTAGGGTAGG3'，引物3：5

6、'ACCAAAAGCTCTCCCCGAAC3'，引物4：5'GGGAGAGCTTTTGGTCTAAGTA3'）由上海生物工程有限责任公司合成，其他试剂均为进口分装。　　1.2方法　　1.2.1正常人TGF-β2基因-270bp~+280bp启动子区报告基因的构建首先利用引物1、引物2从人血DNA中扩增人TGF-β2基因启动子区-270bp~+280bp的基因区段，然后将此PCR产物进行凝胶回收，回收片段与载体pGL3-Basic分别经MluⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，经克隆培养后挑取阳性菌落进行培养，提取质粒后送公司测序。　　1.2.2人TGF-β2基因启动子区

7、突变体基因的构建　　根据人TGF-β62基因启动子区-114位的待突变序列5'CGTG3'设计合成相应的带有突变位点序列的正向和反向特异性引物3和4，两个带有突变位点的引物的5'端重叠约30个碱基，且突变点位于重叠碱基的中央。然后根据定点突变的方法[3-4]，分别利用引物1和4以及2和3扩增突变位点两侧的DNA序列。PCR反应总体积20.0μL：10×Buffer2.0μL,TaqDNApolym