丙型肝炎病毒准种特性的研究进展

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1、丙型肝炎病毒准种特性的研究进展　　丙型病毒性肝炎(丙肝)是一种广泛传播的疾病，是导致慢性病毒性肝炎、肝炎肝硬变、肝细胞癌(HCC)的主要病因之一，而这些病变形成与其病原丙型肝炎病毒（HCV)某些重要的生物学特性有关〔1〕。与其他RNA病毒类似，HCV基因组的易变异性可产生不同的型或亚型，而且在HCV感染者体内可同时存在具有多种序列组成不同但却有很高同源性(同源性≥95%)的HCV变异株病毒群体，即称为HCV准种(Quasispecies)，亦有相似株和类似株之称〔2,3〕。近年来研究表明，HCV准种株决定其某些重要的生物学特性，而且大部分学者己惯用“准种”来监测和量化HCV在患者体

2、内的复制及变异。现就有关研究作一概述。　　1　HCV准种株特性　　1971年Eigen等〔4〕在描述地球早期生命演化时，启用了“准种株”这一概念。以后人们在分析噬菌体Qβ群中单个病毒克隆的RNA时发现“准种株”的确存在，并将其引入了病毒的研究，以求循一个新途径来解释和说明病毒的高度变异性问题〔5〕。HCV属于单股正连RNA病毒，其基因组包膜糖蛋白区E2/NS1基因组C端相对保守，N端含有两个高变区域(Hypervariable13region，HVR)即HVR1(384～410/413aa)和HVR2(474～480aa)。研究发现HVR1含有病毒株特异的中和性抗原表位，它的变异与

3、丙肝慢性化及防治失败密切相关〔6〕。HCV感染者体内可同时存在大量基因序列相关的HCV准种株群体，而且会随病情和/或病程不同而发生变化〔7，8〕。这种序列异质性变异株可发生在HCV基因组的各区段，包括5′-非编码区(5′-UTR)、核心区(C区)、包膜区（E区)及非结构蛋白区(NS区)等均有报道〔9-11〕。最近，Gerotto等〔12〕报道了HCV-NS5A干扰素敏感决定区(IFNSensitivity-determingregion，ISDR)准种特性，认为其会影响到HCV1b型感染者对IFN治疗的应答。但有研究证实约20%序列变异发生在E2/NS1区，HCV准种株特性在HVR

4、1表现较明显而更具有代表性〔11，13，14〕。　　2　HCV准种株的量化　　随着分子生物学技术的广泛应用，目前主要以准种HCV基因的复杂性(Complexity)或异质性(Heterogeneity)程度来对其进行量化，主要有以下几种方法:①直接测序法〔15〕。针对特定区段RNA序列进行体外逆转录扩增（RT-PCR)得到相应的cDNA，然后用PCR扩增产物直接测序或克隆后测序，根据异质性序列种类(diversity)来评价该区段准种株多寡。②单链构象多态性分析法(Single-strandconformation13polymophismanalysis,SSCP)〔l6，l7〕

5、。此法是在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种新方法，将单链扩增DNA(引物已用同位素或荧光标记)通过中性聚丙烯烯胺凝胶电泳(PAGE）和放射自显影，根据其SSCP条带数目及位置不同则可分辨出序列单个碱基和构型改变，由此来判断体内准种株的复杂程度。③异源双链泳动分析法(Heteroduplexmobilityassay,HMA/heteroduplexgelshiftanalysis，GSA),亦称异源双链示踪检测法（Heteroduplextrackingassay,HTA)〔10,18,19〕。此法早期主要用于艾滋病病毒异质性研究，主要原理是基于DNA分子

6、的变性和复性过程。在DNA经过变性后复性时，如反应系统中存在两种或两种以上具有一定同源性的核酸分子链，不同来源的两链同源区可配对形成双链，此即异源双链;异源双链内由于存在碱基错配或不配区域，分子构象发生了改变，不同于同源双链，通过非变性的PAGE，同源性越高，泳动就越快，反之则慢。比较而言，第一种方法结果直接而可靠，但较原始且费力费时，直接PCR产品克隆和序列分析往往不能代表HCV准种株的真实组成，虽容易鉴别出优势序列，但小的克隆很可能被忽略掉。PCR-SSCP法应用较广，但对低于5%的准种株病毒群体亦有可能检测不到，而且操作烦琐〔20〕。相比之下，HMA法操作相对简单省时，可用于

7、基因亚型的测定。这些方法学上的差异在一定程度上可能决定了各学者在研究HCV准种特性时某些结论的不一致，所以寻求一种更准确、简便而重复性较好的方法是必需的。13　　3　HCV准种的优势株与劣势株　　有研究认为〔21，22〕，对HCV准种株群体变化可能有三种解释:①HCV变异是HCV感染人体后随时间变化而自发产生的;②病情严重时，HCV复制更加活跃，复制期间“易错配”(Error-prone)的RNA聚合酶导致了序列变异;③正性免疫选择压力(Positiveimmunes