人线粒体dna荧光定量pcr检测方法的建立

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1、人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立【摘要】建立SYBRGreenI实时荧光PCR定量检测人线粒体DNA的方法。选取人线粒体DNA高度保守基因片段，将该基因片段与pCF-T载体连接后，转化入E.coliDH5α，提取重组质粒PCR及测序鉴定后，作为阳性模板建立SYBR-GreenI荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果表明：构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含101～108拷贝时,扩增反应CT值与拷贝数的对数成线性关系)，相关系数为0.997。批内和批间重复性测定的变异系数分别为1.23%～3.29%以及3.10%～5.21%。我们成功建立了实时荧光定量PCR检测人线粒体DN

2、A的方法，该方法可作为进一步研究线粒体DNA的方法，在相关疾病诊断和监测中具有一定的应用前景。【关键词】SYBRGreenI；荧光定量PCR；线粒体DNA；聚合酶链反应；人Abstract：ToestiblishaSYBR-GreenIfluorescentquantitativePCRmethodtodetecthumanmitochondrialDNA.HumanmitochondrialDNAwasanalyzedandspecialprimersweredesignedandsynthesizedaccordingtotheconservedgenesequence.Thesp

3、ecificfragmentwasclonedintopCF-TvectorwhichwastransformedintoE.coliDH5α.Thepositiverecombinantplasmididentifiedbysequencingwasusedasquantitativetemplateto10generatestandardcurveandmeltcurve.Resultsshowedthatthestandardcurvesuccesfullyshowedalinearrelationshipbetweencyclethreshold(Ct)andtemplatec

4、oncentrationrangingfrom101to108copies,andthecorrelationcoefficientwas0.997.Thecoefficientofvariationvaluesforbothintra-experimentalandinter-experimentalreproducibilityrangedfrom1.23%to3.29%and3.10%to5.21%,respectively.ItmeansthatthemethodfordetectinghumanmitochondrialDNAwithfluorescencequantitat

5、ivepolymerasechainreactionisdevelopedsuccessfully.ItshowsgoodrepeatabilityandsensitivityindetectionofhumanmitochondrialDNA.Thismethodcanfacilitatethepotentialapplicationsinthefieldsoflaboratorydiagnosisanddetection.Keywords：SYBRGreenI;FluorescentqunantitativePCR;MitochondrialDNA；Polymerasechainr

6、eaction；Human1引言10线粒体作为真核细胞中一种重要而独特的细胞器，其性状和数量的改变与人的疾病密切相关。研究线粒体与疾病的关系，既有理论意义，在医学上也有潜在的应用前景。称为细胞动力工厂的线粒体，因其生命周期有限，具有高的更新率，形态、大小、数量和分布常因细胞种类不同而异。本研究旨在建立人线粒体DNA荧光定量PCR方法，为进一步研究线粒体DNA与人的疾病的关系奠定基础。1材料与方法1.1实验材料人EDTA抗凝血2ml，菌种为本室保存的大肠杆菌E.coliDH5α。1.2试剂pCF-T连接试剂盒、PCR反应试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试

7、剂盒等购自TIANGEN公司；BigDyeTerminatorv3.1试剂盒、SYBRPCRMastermix购自ABI公司；人淋巴细胞分离液购自灏洋生物公司。1.3仪器BIO-RAD公司iCycler荧光定量PCR仪，HERAEUS公司高速离心机BIOFUGEPICO，ABI公司970010PCR扩增仪，大和公司恒温金属浴，BECKMAN公司紫外分光光度计DU-640，复星公司电泳仪，KODAK公司凝胶成像系统，ABI公司310测序仪。　　1